本文選題：甘露聚糖結(jié)合凝集素 + 膠原樣區(qū)��； 參考：《第一軍醫(yī)大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 天然免疫是機(jī)體識別病原微生物，抵御病原體感染的第一道防線。甘露聚糖結(jié)合凝集素(mannan-binding lectin，MBL)是天然免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵分子，為肝細(xì)胞分泌的血漿蛋白，屬C型凝集素超家族中膠凝素(collectins)家族成員。MBL籍其模式識別作用選擇性識別多種病原體的糖結(jié)構(gòu)，然后通過激活補(bǔ)體凝集素途徑而發(fā)揮溶破和間接調(diào)理功能，并能與吞噬細(xì)胞膠凝素受體(即C1qR)結(jié)合而啟動(dòng)調(diào)理吞噬，還可介導(dǎo)MBL依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用。而且，MBL也是一個(gè)重要的粘膜表面防御分子。 成熟MBL肽鏈自N端至C端依次有4個(gè)結(jié)構(gòu)域：富含Cys的N端區(qū)、膠原樣區(qū)(collagen-like region，CLR)、頸區(qū)和C端糖識別域(carbohydrate-recognition domain，CRD)。完整MBL分子是同質(zhì)三肽鏈結(jié)構(gòu)單位的寡聚體，多至六聚體。只有高寡聚體MBL分子才具有生物學(xué)活性。CRD是MBL分子的識別功能區(qū)，能選擇性識別多種病原體的糖結(jié)構(gòu)；而CLR是其效應(yīng)功能區(qū)，MBL激活補(bǔ)體和結(jié)合膠凝素受體的功能定位于此區(qū)。MBL分子通過其CLR與MBL相關(guān)絲氨酸蛋白酶(MBL associated serine proteases，MASP1、MASP2)結(jié)合形成復(fù)合物，在其CRD識別、結(jié)合病原微生物的糖結(jié)構(gòu)后，可活化MASPs酶原，從而激活補(bǔ)體凝集素途徑而發(fā)揮天然抗感染免疫效應(yīng)。 MASPs肽鏈由6個(gè)功能區(qū)組成，從N端至C端依次為CUB區(qū)(complement subcomponent C1r／C1s-like domain)、EGF區(qū)(epidermal growth factor-likedomain)、CUB區(qū)、補(bǔ)體調(diào)控蛋白(complement control proteins，CCP)區(qū)、CCP區(qū)和絲氨酸蛋白酶(serine proteases，SP)區(qū)。初步研究表明，N端的3個(gè)結(jié)構(gòu)域即2個(gè)CUB區(qū)和1個(gè)EGF區(qū)是MASPs與MBL-CLR結(jié)合的區(qū)域，能以Ca~(2+)依賴方式與MBL-CLR相互作用。然而，這種相互作用的詳細(xì)情況、特別是MBL-CLR中MASPs結(jié)合位點(diǎn)尚不明了。 已在MBL基因編碼CLR的第一外顯子發(fā)現(xiàn)3個(gè)點(diǎn)突變CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA，而人群中這些點(diǎn)突變的基因頻率極高，可引起血清MBL水平低下及活性降低從而導(dǎo)致調(diào)理吞噬作用缺損。MBL缺損主要表現(xiàn)為各種病原體的反復(fù)急慢性感染，甚至HBV、HIV等特殊病原體的感染及其發(fā)展轉(zhuǎn)歸也與MBL缺損有關(guān)。MBL基因突變還與自身免疫病如(SLE、RA、IgA腎炎及皮肌炎等)密切相關(guān)。然而，MBL基因突變引起免疫缺損的發(fā)病機(jī)理迄今未明。 本實(shí)驗(yàn)研究首先采用原核表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)了MBL-CLR和MASPs蛋白，利用哺乳細(xì)胞表達(dá)了突變MBL蛋白，然后建立MBL與MASPs結(jié)合的體系，合成一系列CLR短肽來阻斷這種結(jié)合，并探索突變MBL蛋白與MASPs的相互作用，以闡述MBL分子CLR精細(xì)的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系。其意義在于：從一個(gè)方面揭示MBL介導(dǎo)天然免疫防御的機(jī)理；有助于闡明MBL基因突變引起調(diào)理吞噬缺損的機(jī)制。 一、人MBL-CLR蛋白的原核表達(dá)及鑒定 使用Primer premier5.0軟件，設(shè)計(jì)并合成引物，以含有漢族人野生型MBL全長編碼區(qū)cDNA的質(zhì)粒pGEM-MBL為模板，PCR擴(kuò)增出長度約180bp的人MBL-CLR基因片段，將其克隆至pET32a原核表達(dá)載體中，構(gòu)建的重組表達(dá)載體經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ酶切后出現(xiàn)約5900bp和180bp的片段，經(jīng)測序鑒定序列正確后，導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中，以IPTG誘導(dǎo)重組pET32a-MBL-CLR質(zhì)粒表達(dá)Trx-CLR融合蛋白。對以可溶性表達(dá)的Trx-CLR融合蛋白經(jīng)Ni+-NTA agarose層析柱純化，獲得了純化的融合蛋白。純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳出現(xiàn)Mr約為30000、60000和120000的3條帶，Western blot分析表明，3條蛋白帶均可與抗His抗體起反應(yīng)，3條蛋白帶對應(yīng)于融合蛋白的單體和寡聚體。ELISA證實(shí)，純化蛋白能與鼠抗重組人MBL蛋白抗體結(jié)合。 二、MASP1、MASP2 N端和C端蛋白的原核表達(dá)及鑒定 使用Primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)并合成引物，分別以含人MASP1、MASP2全長編碼區(qū)cDNA的pGEM-MASP1、pGEM-MASP2質(zhì)粒為模板，分別擴(kuò)增出長度約860bp和840bp的人MASP1和MAS2的N端區(qū)基因片段，分別將其克隆至pGEX-4T-1原核表達(dá)載體中，經(jīng)雙酶切和測序鑒定序列正確后，導(dǎo)入大腸桿菌，以IPTG分別誘導(dǎo)重組pGEX-4T-MASP1-N和pGEX-4T-MASP2-N質(zhì)粒表達(dá)GST-MASP1-N、GST-MASP2-N融合蛋白。對以包涵體形式存在的GST-MASP1-N和GST-MASP2-N融合蛋白經(jīng)8mol／L尿素變性、梯度復(fù)性，獲得結(jié)構(gòu)折疊正確的重組蛋白，經(jīng)GSTrap層析柱純化后，獲得了純化的融合蛋白。經(jīng)ELISA和SDS-PAGE鑒定，證實(shí)為GST-MASP1-N、GST-MASP2-N融合蛋白。同樣構(gòu)建了pET17b-MASP1-C和pET17b-MASP2-C原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)了MASP1-C和MASP2-C蛋白，對以包涵體形式表達(dá)的蛋白進(jìn)行變性復(fù)性后經(jīng)Ni~+-NTA agarose層析柱純化，獲得了純化的MASP1-C和MASP2-C融合蛋白。 三、定位MBL-CLR的MASPs結(jié)合位點(diǎn) 建立MASPs與野生型MBL蛋白和MBL-CLR蛋白結(jié)合的反應(yīng)體系，設(shè)計(jì)合成一系列CLR短肽對MBL與MASPs的結(jié)合進(jìn)行抑制或阻斷實(shí)驗(yàn)。從MBL-CLR蛋白阻斷野生型MBL與MASPs結(jié)合反應(yīng)的結(jié)果來看，MBL-CLR可有效地抑制MASP1-N、MASP2-N蛋白與野生型MBL的結(jié)合，其50％抑制濃度分別為0.3g／L和0.15g／L；MBL-CLR也能很好地與MASP1-N和MASP2-N蛋白結(jié)合，進(jìn)一步證明MASPs確實(shí)是與MBL-CLR結(jié)合。 MBL-CLR區(qū)由59個(gè)氨基酸殘基組成，由19個(gè)規(guī)律的Gly-X-Y膠原三聯(lián)體重復(fù)順序構(gòu)成，其中有一處Gly-Gln斷裂。根據(jù)CLR的序列及特點(diǎn)先后設(shè)計(jì)了9條肽進(jìn)行合成。其中1～4號肽每個(gè)肽約22個(gè)氨基酸殘基，覆蓋了CLR全長59個(gè)氨基酸，并有部分序列重疊；5～8號肽主要針對點(diǎn)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)，，5號肽為野生型，6、7、8號肽分別是含32Cys、34Asp、37Glu殘基的肽。對于MASP1-N、MASP2-N蛋白與重組MBL野生型MBL蛋白、MBL-CLR蛋白的結(jié)合，3號和5號肽有一定抑制作用，抑制率在25％-45％之間，2號肽有較好抑制活性，抑制率可達(dá)50％以上，而1、4、6、7、8號肽抑制作用不明顯。根據(jù)這些結(jié)果，以2號肽序列為主，考慮其與3號和5號肽的重疊部分，重新設(shè)計(jì)合成了9號肽，并將序列中2個(gè)脯氨酸殘基(P)改為羥基脯氨酸(O)：GLRGLQGPOGKLGPOG。抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，9號肽能有效抑制MASP1-N、MASP2-N蛋白與重組野生型MBL蛋白、MBL-CLR蛋白結(jié)合，抑制率達(dá)70％以上。9號肽序列位于MBL-CLR中45～60位氨基酸殘基，正巧是Gly-Gln斷裂之后的16個(gè)殘基。從哺乳動(dòng)物CLR的序列來看，9號肽氨基酸序列是相對保守的，可能各種屬動(dòng)物的MBL均通過這一區(qū)域結(jié)合MASPs。當(dāng)然，這一結(jié)論尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，9號肽與MASPs結(jié)合的親和力仍然偏低，尚需在今后的研究中進(jìn)一步提高短肽的親和力。 同樣也利用MBL-CLR能與U937細(xì)胞膠凝素受體的作用建立了細(xì)胞ELISA的體系，從MBL-CLR與U937細(xì)胞的結(jié)合試驗(yàn)來看，CLR確實(shí)具有膠凝素類似的作用能夠和U937細(xì)胞上的膠凝素受體結(jié)合。但從合成肽抑制試驗(yàn)來看，沒有肽段起到有效的抑制作用，這表明CLR與U937細(xì)胞的膠凝素的結(jié)合位點(diǎn)并不同于MASPs的結(jié)合位點(diǎn)，而真正的結(jié)合位點(diǎn)仍需進(jìn)一步研究。 四、突變型MBL蛋白與MASPs的結(jié)合作用 MASP1-N和MASP2-N蛋白不僅能與重組野生型MBL蛋白結(jié)合也能與32Cys、34Asp、37Glu突變型MBL蛋白結(jié)合，然而，在同樣的包被濃度下，與野生型MBL蛋白的結(jié)合力高于其它3種突變蛋白。在同等條件下，32Cys突變型蛋白與MASP1-N、MASP2-N蛋白的結(jié)合力最低，與34Asp突變型蛋白的結(jié)合力次之，與37Glu突變蛋白的結(jié)合力相對較高。此外，9號合成肽可以抑制MASP1-N和MASP2-N蛋白與3種突變型MBL蛋白結(jié)合。結(jié)果表明，MBL-CLR的這3個(gè)點(diǎn)突變與MBL的MASPs結(jié)合位點(diǎn)不重疊，雖然對MBL與MASPs的結(jié)合有一定影響，但推測是MBL點(diǎn)突變導(dǎo)致MBL寡聚化程度降低而影響其MASPs結(jié)合親和力，而非突變產(chǎn)物的直接效應(yīng)。
[Abstract]:Natural immunity is the first defense against pathogen infection , which is a key molecule in the innate immune system . The mannan - binding lectin is a key molecule in the innate immune system .






There are four domains from the N - terminal to the C - terminus of the mature peptide chain : the N - terminal region rich in Cys , the collagen - like region ( CLR ) , the neck region and the C - terminal sugar recognition domain ( CRD ) . The intact mbl molecule is an oligomer of the homogeneous tripeptide chain structure unit , which is a poly - to - hexamer . Only the high oligomeric mbl molecule has biological activity . the crd is the recognition functional region of the mbl molecule , which can selectively recognize the sugar structure of a plurality of pathogens ;
In this region , the function of the binding lectin receptor is localized in the region . The binding of the binding agent and the binding of the binding lectin receptor in the region is localized in this region .






The MASPs peptide chain consists of six functional zones , from the N - terminal to the C - terminus , the CUB region , the epidermal growth factor - like domain , the CUB region , the complement regulatory protein ( CCP ) region , the CCP region and the serine protease ( SP ) region .






Three point mutations CGT52TGT , GGC54GAC and GGA57GAA have been found in the first exon encoding the CLR gene . The gene frequency of these mutations in the population is extremely high , which can lead to low levels of serum levels and decreased activity .






In this study , we used prokaryotic expression system to express the protein of the protein , the expression of the mutein , the expression of the mutein in the mammalian cell , and then establish a system of binding to MASPs , synthesize a series of CLR short peptides to block the binding , and explore the structure - functional relationship between the mutein and MASPs .
It is helpful to elucidate the mechanism of modulating the phagocytosis of the defect caused by the gene mutation of the mbl .






Prokaryotic Expression and Identification of One - and One - Man - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1






The recombinant expression vector was cloned into the prokaryotic expression vector of pET32a . The recombinant expression vector was cloned into the prokaryotic expression vector pET32a . The recombinant expression vector was cloned into the prokaryotic expression vector of pET32a . After sequencing , the recombinant expression vector was cloned into E . coli BL21 ( DE3 ) .






Prokaryotic expression and identification of two , MASP1 , MASP2 N - terminal and C - terminal proteins






The expression vector of GST - MASP1 - N and GST - MASP2 - N was amplified by ELISA and SDS - PAGE .






III . Binding site of MASPs to locate the mbl - CLR






The binding of MASP1 - N , MASP2 - N protein to wild - type mbl was inhibited and the 50 % inhibition concentration was 0.3g / L and 0.15g / L , respectively .
The binding of MASP1 - N and MASP2 - N proteins is also well demonstrated by the binding of the MASPs to the MASP1 - N and MASP2 - N proteins .






According to the sequence and characteristics of the CLR , 9 peptides were synthesized .
No . 9 peptide has a certain inhibitory effect on the binding of MASP1 - N , MASP2 - N protein and recombinant wild - type mbl protein , and the inhibition rate can reach more than 50 % .






In the same way , the binding sites of the binding sites of the binding sites of the binding sites of the binding sites of the binding sites of the binding sites of the binding sites of the binding sites of the binding sites of the binding sites of the binding sites of the binding sites of the binding sites of the binding sites of the binding sites of the binding sites of the binding sites of the binding sites of the binding sites of the masPs and the binding sites of the binding sites of the MASPs are different , and the true binding sites still need further study .






Study on the Binding Effect of Mutant Protein - protein and MASPs






The binding force of MASP1 - N and MASP2 - N protein was higher than that of the other three mutant proteins .
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 張京芬;MBL介導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞對煙曲霉菌的固有免疫反應(yīng)[D];青島大學(xué);2011年

2 王曉雪;IL-6與IL-10在大鼠真菌性角膜炎固有免疫階段角膜上皮組織中的表達(dá)[D];青島大學(xué);2012年

本文編號：2000635