本文選題：人抑瘤素M + 真核表達(dá)�。� 參考：《蘇州大學(xué)》2005年碩士論文

【摘要】：目的:克隆人抑瘤素(hOSM)基因,在COS7細(xì)胞和WI-38細(xì)胞中進(jìn)行重組表達(dá)并檢測(cè)表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性,初步闡明OSM細(xì)胞因子的抑瘤作用以及在造血中的作用,為OSM的基礎(chǔ)和應(yīng)用性研究打下基礎(chǔ)。 方法:用PMA刺激U937細(xì)胞,抽提總RNA,經(jīng)RT-PCR獲得cDNA,與pUCm-T載體連接后,經(jīng)PCR獲得全長(zhǎng)hOSM基因,再與pcDNA3.1/myc-his(-)A真核表達(dá)載體連接,構(gòu)建重組體pcDNA3.1A-hOSM,采用PCR、限制性酶雙酶切法鑒定和經(jīng)DNA測(cè)序正確后在COS-7細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),采用RT-PCR鑒定hOSM基因的轉(zhuǎn)錄,MTT法研究表達(dá)產(chǎn)物對(duì)A375細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制活性。并將pcDNA3.1A-hOSM真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染W(wǎng)I-38細(xì)胞,經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞;采用RT-PCR鑒定hOSM基因在WI-38細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄,MTT法研究表達(dá)產(chǎn)物抑制A375細(xì)胞和A549細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)特性,流式細(xì)胞儀法測(cè)定A375細(xì)胞的細(xì)胞周期,利用原代培養(yǎng)的第4代骨髓基質(zhì)細(xì)胞研究hOSM對(duì)造血的支持作用。 結(jié)果:重組入載體中的基因片段不僅方向正確,而且所克隆的片段確為hOSM基因,與GeneBank報(bào)導(dǎo)序列完全一致,并成功的在COS-7細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)了具有抑制A375細(xì)胞生長(zhǎng)rhOSM蛋白。獲得穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因WI-38細(xì)胞,rhOSM表達(dá)產(chǎn)物能引起A375細(xì)胞的細(xì)胞周期G1→S
[Abstract]:Objective: to clone the hOSM gene, express it in COS7 cells and WI-38 cells, detect the biological activity of the expressed protein, and elucidate the anti-tumor effect of OSM cytokines and its role in hematopoiesis. It lays a foundation for the basic and applied research of OSM. Methods: U937 cells were stimulated with PMA, total RNAs were extracted, cDNAs were obtained by RT-PCR, ligated with pUCm-T vector, then the full-length hOSM gene was obtained by PCR, and then connected with pcDNA3.1/myc-his(-)A eukaryotic expression vector. The recombinant pcDNA3.1A-hOSMwas constructed and expressed in COS-7 cells by PCR, restriction enzyme digestion and DNA sequencing. RT-PCR was used to identify the growth inhibitory activity of hOSM gene on A375 cells. The pcDNA3.1A-hOSM eukaryotic expression vector was transfected into WI-38 cells, and the stable expression transgenic cells were obtained by G418 screening. RT-PCR was used to identify the expression of hOSM gene in WI-38 cells to study the biological characteristics of the expression products inhibiting the growth of A375 cells and A549 cells. The cell cycle of A375 cells was measured by flow cytometry, and the supporting effect of hOSM on hematopoiesis was studied by primary cultured bone marrow stromal cells (BMSCs). Results: the recombinant gene fragment was not only in the right direction, but also a hOSM gene cloned, which was completely consistent with the GeneBank report sequence. The recombinant gene was successfully expressed in COS-7 cells by transient expression of rhOSM protein which could inhibit the growth of A375 cells. Stable expression of rhOSM in transgenic WI-38 cells can induce cell cycle G1 / S of A375 cells
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：1974076