本文選題：單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞 + 膜聯(lián)蛋白Ⅰ�。� 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DCs)是一種專職抗原遞呈細(xì)胞(APCs),能夠啟動(dòng)初始T細(xì)胞活化、增殖、分化并產(chǎn)生免疫效應(yīng),在免疫系統(tǒng)中居于獨(dú)特的地位。成熟DCs能夠激發(fā)免疫應(yīng)答,而不成熟DCs則涉及免疫耐受的誘導(dǎo)。因此,研究調(diào)節(jié)DCs發(fā)育成熟的因素及其機(jī)制,對(duì)于闡明自身免疫病、移植排斥反應(yīng)、抗腫瘤免疫等的機(jī)制和探索防治措施有著重要的意義。 神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間存在雙向調(diào)節(jié)作用。神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)主要通過激素及神經(jīng)通路來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能,而免疫系統(tǒng)則通過細(xì)胞因子等免疫分子對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。這種相互作用形成復(fù)雜的整體調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),對(duì)于抵御疾病、維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要的作用。 α-黑素細(xì)胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)由13個(gè)氨基酸組成,是神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)中的重要分子之一。α-MSH不僅影響黑素生成過程,而且具有多種生物學(xué)活性,其明顯的抗炎、退熱及免疫調(diào)節(jié)作用越來越引起人們的重視。有文獻(xiàn)報(bào)道,人外周血單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞(monocyte-derived dendritic cell ,MoDCs)表達(dá)α-MSH的受體MC1R。α-MSH通過MC1R可引起MoDCs表達(dá)CD86和CD40下降。本室以往的研究表明,α-MSH有逆轉(zhuǎn)TNF-α誘導(dǎo)的MoDC(sTNF-α-MoDCs)成熟的作用。為探討α-MSH逆轉(zhuǎn)TNF-α-MoDCs成熟的作用機(jī)制,我們采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,膜聯(lián)蛋白Ⅰ(Annexin A1, ANXA1)在α-MSH處理的TNF-α-MoDCs中表達(dá)明顯升高。 ANXA1亦被稱為lipocortin1,屬于ANXA超家族,是具有Ca2+以及磷脂結(jié)合活性的37kDa的蛋白。ANXA1最初被認(rèn)為是糖皮質(zhì)激素(GC)作用于大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)蛋白,隨后研究發(fā)現(xiàn),ANXA1還是細(xì)胞胞內(nèi)和胞間的信號(hào)分子,在細(xì)胞的很多生命活動(dòng)中起重要作用,比如細(xì)胞分化、凋亡、膜泡融合、內(nèi)吞、胞吐以及對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)等。 在α-MSH逆轉(zhuǎn)TNF-α-MoDCs的成熟過程中,ANXA1表達(dá)增多,是否意味著ANXA1在MoDCs成熟過程中起到重要作用呢?我們構(gòu)建了ANXA1的高表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TNF-α-MoDCs,檢測(cè)MoDCs的表型、吞噬能力、細(xì)胞因子分泌以及刺激同種異體T細(xì)胞增殖的能力,以驗(yàn)證ANXA1表達(dá)增多是否能夠逆轉(zhuǎn)TNF-α-MoDCs的成熟。另一方面,我們?cè)O(shè)計(jì)了ANXA1-siRNA并轉(zhuǎn)染TNF-α+NDP-MSH-MoDCs。用ANXA1-siRNA干擾TNF-α+NDP-MSH-MoDCs中ANXA1的表達(dá),檢測(cè)MoDCs的表型、吞噬能力、細(xì)胞因子分泌以及刺激同種異體T細(xì)胞增殖的能力。我們通過以上實(shí)驗(yàn),試圖證明:①ANXA1是否參與α-MSH/NDP-MSH逆轉(zhuǎn)TNF-α-MoDCs成熟的信號(hào)通路;②ANXA1高表達(dá)是否能夠逆轉(zhuǎn)TNF-α-MoDCs的成熟。 在本課題第一部分,我們從U937細(xì)胞中通過RT-PCR法得到ANXA1片段,通過轉(zhuǎn)化、抽提、純化、雙酶切和連接等分子克隆技術(shù),構(gòu)建了ANXA1高表達(dá)質(zhì)粒pShuttle-CMV-ANXA1。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293a細(xì)胞,可高表達(dá)ANXA1蛋白,說明質(zhì)粒構(gòu)建成功。將空質(zhì)粒pShuttle-CMV轉(zhuǎn)染TNF-α-MoDCs,形成空質(zhì)粒對(duì)照組:TNF-α+pShuttle-CMV-MoDCs;將pShuttle-CMV-ANXA1轉(zhuǎn)染TNF-α-MoDCs,形成ANXA1高表達(dá)組:TNF-α+pShuttle-CMV-ANXA1-MoDCs,與前者相比,其表達(dá)ANXA1增多。由于轉(zhuǎn)染試劑的毒性作用,與TNF-α-MoDCs相比,空質(zhì)粒對(duì)照組也顯示出進(jìn)一步的成熟。與空質(zhì)粒對(duì)照組相比, ANXA1高表達(dá),可以引起MoDCs表面標(biāo)志CD86表達(dá)減少,以及CD1a表達(dá)增多(在本實(shí)驗(yàn)體系中,MoDCs的成熟伴隨著CD1a的減少,與Xiaochun Cao報(bào)道的結(jié)果一致);但是,HLA-DR表達(dá)增多,MoDCs吞噬能力進(jìn)一步降低,細(xì)胞因子IL-10分泌減少,IL-12p40分泌增多,刺激同種異體T細(xì)胞增殖的能力加強(qiáng)。由于ANXA1一般被認(rèn)為是一種炎癥抑制因子,上述結(jié)果與我們預(yù)期ANXA1的高表達(dá)可以一定程度地抑制MoDCs的成熟并不一致。但我們的結(jié)果與Tomoko Smyth等的研究發(fā)現(xiàn)有類似之處,雖然注射外源ANXA1的N端短肽可以使LPS刺激的巨噬細(xì)胞表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)減少,但是內(nèi)源性ANXA1的高表達(dá)可以使LPS刺激的巨噬細(xì)胞表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)增多。我們推測(cè),ANXA1高表達(dá)并不能完全模擬α-MSH/NDP-MSH所引發(fā)的逆轉(zhuǎn)TNF-α-MoDCs成熟的信號(hào)通路,所以并沒有產(chǎn)生類似于α-MSH/NDP-MSH對(duì)TNF-α-MoDCs的成熟逆轉(zhuǎn)作用。再者,或許有另一種可能,即適量的ANXA1表達(dá)對(duì)于維持MoDCs的不成熟狀態(tài)非常重要,過量表達(dá)反而會(huì)促進(jìn)TNF-α-MoDCs的成熟。 在本課題第二部分,我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了ANXA1-siRNA。將non-siRNA轉(zhuǎn)染TNF-α+NDP-MSH-MoDCs ,形成非干擾對(duì)照組: TNF-α+NDP-MSH +non-siRNA-MoDCs;將ANXA1-siRNA轉(zhuǎn)染TNF-α+NDP-MSH-MoDCs,形成ANXA1干擾組:TNF-α+NDP-MSH+ANXA1-siRNA-MoDCs,與前者相比,此組ANXA1表達(dá)減少。與TNF-α+NDP-MSH+non-siRNA-MoDCs相比,TNF-α+NDP-MSH +ANXA1-si R N A-MoDCs表面標(biāo)志HLA-DR表達(dá)增多,CD1a表達(dá)減少,吞噬能力下降,細(xì)胞因子IL-10的分泌下降,IL-12p40分泌增多,刺激同種異體T細(xì)胞增殖的能力增強(qiáng)。這說明,干預(yù)MoDCs中的ANXA1表達(dá)可以促進(jìn)MoDCs成熟;ANXA1參與α-MSH/NDP-MSH逆轉(zhuǎn)TNF-α-MoDCs成熟的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。 綜合兩部分結(jié)果提示,ANXA1在MoDCs成熟過程中起一定的作用;ANXA1參與α-MSH/NDP-MSH逆轉(zhuǎn)TNF-α-MoDCs成熟的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。本實(shí)驗(yàn)為闡明α-MSH的抗炎和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制,以及探明DC發(fā)育成熟和功能的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:Dendritic cells ( DCs ) are a full - time antigen presenting cell , which can activate the activation , proliferation , differentiation of initial T cells and produce immune effects . The mature DCs can stimulate the immune response , while immature DCs can induce immune tolerance . Therefore , it is important to study the mechanisms of regulating the development of DCs and to explore the mechanisms of immune tolerance .






Neuroendocrine system regulates the function of the immune system mainly through hormone and nerve pathways , while the immune system regulates the function of neuroendocrine system through the immune molecules such as cytokines . This interaction forms a complex overall regulatory network , which plays an important role in resisting diseases and maintaining the stability of the environment in the organism .






偽 - MSH is one of the most important molecules in the regulation of TNF - 偽 - MoDCs . The results showed that 偽 - MSH could reverse the maturation of TNF - 偽 - MoDCs .






ANXA1 is also known as lipocortin1 , which belongs to the ANXA superfamily and is a 37 kDa protein with Ca2 + and phospholipid binding activity . ANXA1 was originally thought to be an inducible protein of glucocorticoid ( GC ) acting on peritoneal macrophages in rats . It was found that ANXA1 also plays an important role in many life activities of cells , such as cell differentiation , apoptosis , membrane vesicle fusion , endocytosis , exocytosis , and protection of neurons .






We constructed ANXA1 - siRNA and transfected TNF - 偽 + NDP - MSH - MoDCs . We designed ANXA1 - siRNA and transfected TNF - 偽 + NDP - MSH - MoDCs .






In the first part of the subject , we obtained an ANXA1 fragment by RT - PCR from the cells of the cells . The expression of ANXA1 was increased . Compared with the control group , the expression of ANXA1 was increased . The expression of TNF - 偽 + pShuttle - CMV - MoDCs could be inhibited .






TNF - 偽 + NDP - MSH + ANXA1 - siRNA - MoDCs transfected with TNF - 偽 + NDP - MSH + ANXA1 - siRNA - MoDCs . Compared with the former , the expression of TNF - 偽 + NDP - MSH + ANXA1 - siRNA - MoDCs decreased . Compared with the former , the expression of TNF - 偽 + NDP - MSH + ANXA1 - siRNA - MoDCs was decreased . Compared with the former , the expression of TNF - 偽 + NDP - MSH + ANXA1 - siRNA - MoDCs was decreased .






The results suggest that ANXA1 plays a role in the maturation of MoDCs ; ANXA1 is involved in the signal transduction process of 偽 - MSH / NDP - MSH to reverse the maturation of TNF - 偽 - MoDCs .
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1965084