本文選題：HIV-1 + gp120　； 參考：《中南大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 背景:HIV引起的艾滋病(AIDS)自被發(fā)現(xiàn)以來(lái),一直嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康,目前無(wú)有效的預(yù)防措施,抗HIV藥價(jià)格昂貴,易引起不良反應(yīng),療效也不盡人意。近年來(lái),活病毒載體疫苗的研究受到了越來(lái)越多的重視,HIV-1的gp120基因一直是艾滋病疫苗研究的重點(diǎn)。缺陷性脊髓灰質(zhì)炎病毒可誘導(dǎo)系統(tǒng)性的體液免疫、細(xì)胞免疫和腸道粘膜免疫,缺失P1區(qū)蛋白編碼序列的脊髓灰質(zhì)炎病毒突變體能自我復(fù)制,且其質(zhì)量、安全檢測(cè)手段已經(jīng)完善建立。因而應(yīng)用缺陷性脊髓灰質(zhì)炎病毒表達(dá)載體構(gòu)建含HIV-1gp120基因重組疫苗有很大的應(yīng)用前景,目前國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)用脊髓灰質(zhì)炎病毒表達(dá)載體構(gòu)建HIV重組疫苗的正式報(bào)道。 目的:為有效的控制艾滋病的流行,為進(jìn)一步研究預(yù)防性或治療性的HIV疫苗提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究以pT7gp120基因?yàn)槟０?缺陷性脊髓灰質(zhì)炎病毒為載體,構(gòu)建含HIV-1gp120基因抗原決定簇的重組缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒,并研究其表達(dá)、形態(tài)及遺傳穩(wěn)定性。 方法:1、構(gòu)建重組HIV-1gp120基因脊髓灰質(zhì)炎病毒表達(dá)載體:選擇了中國(guó)HIV-1B亞型代表毒株,以質(zhì)粒pT7gp120為模板,缺陷性脊髓灰質(zhì)炎病毒為載體,構(gòu)建含HIV-1gp120基因抗原決定簇的重組缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒,并通過(guò)PCR、酶切鑒定證實(shí)HIV-1gp120基因片段是否正確的插入到脊髓灰質(zhì)炎病毒載體。2、HIV-1 gp120基因的表達(dá)的檢測(cè):1)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,用G418試劑對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行壓力篩選,得到轉(zhuǎn)入重組脊髓灰質(zhì)炎病毒表達(dá)載體的細(xì)胞株Hela-gp120,通過(guò)RT-PCR檢測(cè)混合細(xì)胞系中HIV-1gp120基因的表達(dá),鑒定是否有目的基因的插入;2)通過(guò)免疫酶法檢測(cè)混合細(xì)胞系中HIV-1 gp120基因的表達(dá),檢測(cè)到是否有目的基因的表達(dá);3)將重組病毒感染293細(xì)胞,經(jīng)過(guò)Western blot方法檢測(cè)重組缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒是否能感染細(xì)胞并表達(dá)目的基因片段的蛋白產(chǎn)物。3、重組HIV-1gp120基因脊髓灰質(zhì)炎病毒形態(tài)觀察:通過(guò)重組痘苗病毒提供缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒的衣殼蛋白,組裝重組脊髓灰質(zhì)炎病毒完整顆粒,并通過(guò)氯仿-PEG/NaCl-氯仿三步法純化重組脊髓灰質(zhì)炎病毒,電鏡下觀察重組病毒形態(tài)。4、重組HIV-1gp120基因脊髓灰質(zhì)炎病毒安全性及遺傳穩(wěn)定性觀察:將重組脊髓灰質(zhì)炎病毒感染的293細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)傳代檢測(cè)疫苗的安全性及遺傳穩(wěn)定性。 結(jié)果:1、構(gòu)建重組HIV-1gp120基因脊髓灰質(zhì)炎病毒通過(guò)PCR,酶切鑒定證實(shí)HIV-1gp120基因片段正確的插入到脊髓灰質(zhì)炎病毒載體。2、用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得的細(xì)胞株Hela-gp120,1)RT-PCR檢測(cè)混合細(xì)胞系中HIV-1 gp120基因的表達(dá),鑒定有目的基因的插入;2)通過(guò)免疫酶法檢測(cè)混合細(xì)胞系中HIV-1 gp120基因的表達(dá),檢測(cè)到有目的基因的表達(dá);3)將重組病毒感染293細(xì)胞,經(jīng)過(guò)Western blot方法檢測(cè)重組缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒能感染細(xì)胞并表達(dá)目的基因。3、電鏡下觀察重組病毒顆粒呈直徑20-30nm的對(duì)稱(chēng)二十面體,具有典型的脊髓灰質(zhì)炎病毒顆粒形態(tài)。4、重組脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗具有安全性及遺傳穩(wěn)定性。 結(jié)論:1、成功構(gòu)建了含HIV-1gp120基因片段重組脊髓灰質(zhì)炎病毒,且能在體外表達(dá)HIV-1gp120基因片段;2、構(gòu)建的含HIV-1gp120基因片段重組脊髓灰質(zhì)炎病毒,形態(tài)呈直徑20-30nm的對(duì)稱(chēng)二十面體,具有典型的脊髓灰質(zhì)炎病毒顆粒形態(tài);能夠感染293細(xì)胞,并具有遺傳穩(wěn)定性。3、本研究為深入研究含HIV-1 gp120基因片段重組脊髓灰質(zhì)炎病毒的免疫原性,以及其能誘導(dǎo)出強(qiáng)大的體液免疫和細(xì)胞免疫打下了基礎(chǔ),為更好的防治HIV的感染提供了實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。
[Abstract]:鑳屾櫙:HIV寮曡搗鐨勮壘婊嬬梾(AIDS)鑷鍙戠幇浠ユ潵,涓，

本文編號(hào)：1951369