本文選題：巨噬細(xì)胞 + 促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素�。� 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 研究背景與目的 促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)是下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)軸上游重要的神經(jīng)激素和調(diào)節(jié)因子之一,通過(guò)調(diào)節(jié)垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素(arenocorticotrophic hormone,ACTH)來(lái)控制糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)在腎上腺皮質(zhì)的分泌。Urocortin(UCN)則是近年發(fā)現(xiàn)的CRH結(jié)構(gòu)相關(guān)肽之一,它可與CRH受體家族的兩個(gè)主要成員CRH-R1和CRH-R2結(jié)合來(lái)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn),CRH和UCN與免疫系統(tǒng)關(guān)系密切,不僅可通過(guò)調(diào)控HPA軸上GC的釋放來(lái)調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng);還可通過(guò)免疫細(xì)胞表面的CRH受體,發(fā)揮直接的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。哺乳動(dòng)物在正常生理及應(yīng)激條件下外周血CRH和UCN濃度均較低,但是在炎癥局部則存在較高水平的CRH和UCN。研究證實(shí)部分免疫細(xì)胞可表達(dá)CRH和UCN,其表達(dá)水平在細(xì)胞免疫激活后會(huì)顯著上調(diào)。因此,目前普遍認(rèn)為參與直接調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能的外周CRH和UCN主要來(lái)源于炎癥反應(yīng)局部,通過(guò)自分泌和旁分泌方式發(fā)揮作用。巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)啟動(dòng)細(xì)胞之一,參與了細(xì)胞和體液免疫過(guò)程,是重要的殺微生物效應(yīng)細(xì)胞,在感染等疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。內(nèi)毒素(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分,是革蘭氏陰性菌感染時(shí)誘發(fā)炎癥反應(yīng)的主要物質(zhì)之一;它可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放TNF-α等炎癥介質(zhì),外源性CRH和UCN及其受體拮抗劑可顯著影響LPS的該作用效應(yīng),并改變了內(nèi)毒素血癥小鼠的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸;LPS也可引起巨噬細(xì)胞表面的TLR4上調(diào),而外源性CRH及UCN增強(qiáng)了LPS的該作用效應(yīng)。因此,CRH及UCN在LPS介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞功能改變中發(fā)揮了重要作用;但是LPS作用于巨噬細(xì)胞后,內(nèi)源性CRH和UCN在巨噬細(xì)胞的表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制目前仍不清楚。 因此,本課題旨在探討內(nèi)毒素作用后巨噬細(xì)胞表達(dá)CRH和UCN的規(guī)律及其可能的表達(dá)調(diào)控通路。 材料與方法 本課題在體外分離培養(yǎng)健康、成年(230～270g)Wistar大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的基礎(chǔ)上,利用RT-PCR及ELISA技術(shù)進(jìn)行以下幾個(gè)方面的研究:(1)檢測(cè)正常培養(yǎng)的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中CRH和UCN mRNA及多肽含量,了解CRH及UCN在正常巨噬細(xì)胞的表達(dá)水平;(2)用5ng/ml或25ng/ml佛波脂(TPA)處理培養(yǎng)的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞,檢測(cè)處理后1h、2h、4h、8h細(xì)胞中CRH及UCN mRNA及多肽含量變化,觀(guān)察CRH及UCN在活化腹腔巨噬細(xì)胞的表達(dá)規(guī)律;(3)用10ng/ml或100ng/ml LPS處理培養(yǎng)的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞,體外模擬內(nèi)毒素血癥條件,檢測(cè)處理1h、2h、4h、8h時(shí)細(xì)胞中CRH及UCN mRNA及多肽含量變化,揭示內(nèi)毒素作用下巨噬細(xì)胞表達(dá)CRH及UCN的變化規(guī)律;(4)在加入LPS前30min分別用不同濃度的特異性阻斷劑預(yù)處理細(xì)胞阻斷MAPK(mitogenactivatedprotein kinase,絲裂原活化蛋白激酶)信號(hào)通路中的關(guān)鍵激酶:10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L PD98059阻斷細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signalregulated kinase1/2,ERK1/2),10μmol/L、50μmol/L SB203580阻斷c-Jun N端蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK),10μmol/L、50μmol/L SP600125阻斷p38MAPK;再用100ng/ml LPS處理細(xì)胞。在LPS刺激細(xì)胞4h時(shí),檢測(cè)細(xì)胞中CRH mRNA及多肽含量變化,探討MAPK信號(hào)通路在LPS調(diào)控巨噬細(xì)胞表達(dá)CRH中的作用。 主要結(jié)果 1.在正常體外培養(yǎng)的大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中,轉(zhuǎn)錄一定水平的CRH及UCNmRNA(n=8);并合成一定水平的CRH及UCN多肽,胞溶部分CRH多肽約為0.07±0.01ng/10~7cells(n=6),UCN多肽約為1.0±0.50ng/10~7cells(n=6)。 2.TPA呈時(shí)間依賴(lài)性上調(diào)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中CRH及UCN的表達(dá)。CRH mRNA水平在TPA處理細(xì)胞8h時(shí)達(dá)峰值(p＜0.01,n=8),約為對(duì)照組的2.1倍,不同劑量組間無(wú)顯著差異;胞溶部分CRH多肽含量在25ng/ml TPA處理細(xì)胞8h時(shí)達(dá)峰值(p＜0.01,n=6),約為對(duì)照組的2.0倍,為0.14±0.03 ng/10~7cells。UCN mRNA水平在TPA處理細(xì)胞4h時(shí)達(dá)峰值(p＜0.01,n=8),約為對(duì)照組的2.1～2.3倍,不同劑量組間無(wú)顯著差異;胞溶部分UCN多肽含量在25ng/ml TPA處理細(xì)胞8h時(shí)達(dá)峰值(p＜0.01,n=6),約為對(duì)照組的7.1倍,為7.01±0.74 ng/10~7cells。 3.LPS呈時(shí)間依賴(lài)性上調(diào)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞中CHR及UCN的表達(dá)。CRHmRNA在LPS處理4h時(shí)達(dá)峰值(p＜0.01,n=8),約為對(duì)照組的1.9～2.1倍,不同劑量組間無(wú)顯著差異;胞溶部分CRH多肽含量在濃度為100ng/ml的LPS處理2h時(shí)達(dá)峰值(p＜0.01,n=6),約為0.30±0.07ng/10~7cells,在8h時(shí)CRH多肽含量仍保持在0.15±0.07ng/10~7cells,約為對(duì)照組的2.1倍。UCN mRNA在LPS處理4h時(shí)達(dá)峰值(p＜0.01,n=8),約為對(duì)照組的1.8～2.0倍,不同劑量組間無(wú)顯著差異;胞溶部分UCN多肽在100ng/mlLPS處理8h時(shí)達(dá)峰值(p＜0.01,n=6),約為8.68±1.25ng/10~7cells。 4.ERK1/2特異性阻斷劑PD98059呈劑量依賴(lài)性抑制LPS誘導(dǎo)的CRH表達(dá)上調(diào),其最大抑制效應(yīng)濃度為100μmol/L,抑制效率在mRNA水平達(dá)95%(n=8),在多肽水平達(dá)90%(n=6);c-JNK特異性阻斷劑SB203580、p38MAPK特異性阻斷劑SP600125也呈劑量依賴(lài)性抑制LPS誘導(dǎo)的CRH表達(dá)上調(diào),其濃度為50μmol時(shí)抑制效應(yīng)在mRNA水平分別達(dá)41%、49%。 結(jié)論 1.正常腹腔巨噬細(xì)胞有CRH及UCN表達(dá),提示它們?cè)诰S持正常巨噬細(xì)胞及其它免疫細(xì)胞功能中的潛在意義。 2.佛波脂促進(jìn)了CRH及UCN在巨噬細(xì)胞的表達(dá);在內(nèi)毒素作用的巨噬細(xì)胞,CRH及UCN迅速上調(diào)并維持在較高水平,提示激活的巨噬細(xì)胞可能轉(zhuǎn)錄合成大量CRH和UCN,參與炎癥局部的病理生理調(diào)節(jié)活動(dòng)。 3.LPS上調(diào)CRH在腹腔巨噬細(xì)胞的表達(dá)主要依賴(lài)于MAPK信號(hào)通路,其中ERK1/2信號(hào)通路最為重要。 4.在正常及LPS刺激后的腹腔巨噬細(xì)胞,UCN的多肽含量均遠(yuǎn)高于CRH含量;并且UCN與CRH受體家族有更高的親和力,我們推測(cè)UCN在免疫調(diào)節(jié)中可能較CRH更有意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類(lèi)號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：1938732