本文選題：氟 + 血管內(nèi)皮細(xì)胞　； 參考：《山東大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 目的 本實(shí)驗(yàn)通過綜合運(yùn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞免疫組化技術(shù)、流式細(xì)胞儀技術(shù)及相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè)等多種方法初次研究不同濃度的氟對(duì)體外培養(yǎng)的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長與功能的影響，觀察不同氟濃度與血管內(nèi)皮細(xì)胞活性與功能的關(guān)系，為探討微量元素氟對(duì)人體的影響與作用提供有效的實(shí)驗(yàn)支持，豐富對(duì)氟的實(shí)驗(yàn)研究。 材料與方法1、培養(yǎng)：以含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株304(HUECV-304)，傳代待細(xì)胞生長狀態(tài)穩(wěn)定后進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。 2、制備單細(xì)胞懸液密度為0.8～1.0×10~5個(gè)／ml，種24孔板，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的氟化鈉溶液，每板均設(shè)對(duì)照組，于4、8、12、24、48小時(shí)觀察細(xì)胞生長狀況及細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，留取培養(yǎng)液待測(cè)。 3、MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：在氟處理后的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔添加MTT試劑2μl(5mg／ml)，37℃孵育4h、8h、12h、24h及48h后終止培養(yǎng)，小心棄去培養(yǎng)液，用胰酶消化細(xì)胞，每孔加入15μl二甲基亞砜(DMSO)溶解，振蕩10min。用酶標(biāo)分析儀在490nm波長下測(cè)其光吸收值(A)，可間接反映細(xì)胞增殖情況。 4、免疫組織化學(xué)：將消毒好的蓋玻片放入24孔培養(yǎng)板，接種細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后加入各實(shí)驗(yàn)因素，培養(yǎng)24h后終止。除去培養(yǎng)液，PBS沖洗，滴加一抗二抗，顯色前用鑷子小心將蓋玻片取出進(jìn)行DAB顯色，觀察PCNA，，Ki-67的表達(dá)。 5、流式細(xì)胞術(shù)：待測(cè)細(xì)胞經(jīng)離心—PBS沖洗—吹勻—固定—再離心—沖洗—吹打—染色(4℃，20～30分鐘)后，400目尼龍網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測(cè)。Cell quest分析軟件分析，用細(xì)胞分裂增埴指數(shù)(PI)表示相對(duì)增殖活力。PI=(S+G_2／M)／(G_0／G_1+S+G_2／M)。 6、代謝功能檢測(cè)：利用試劑盒對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中細(xì)胞脂質(zhì)過氧化酶丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)和超氧化物岐化酶(SOD)進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果 1、培養(yǎng)4h～48h時(shí)，120～240umol／L劑量組對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活力有明顯刺激作用，表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目增多，隨著氟作用時(shí)間的延長及氟濃度的增加，刺激細(xì)胞增殖的能力明顯減弱，在720～960μmol／L劑量時(shí)細(xì)胞改變最為明顯，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變，細(xì)胞呈長梭形、星形，似成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞收縮，細(xì)胞間隙加寬，胞漿中出現(xiàn)暗色顆粒。 2、加氟培養(yǎng)后24h血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫組化顯示120～240μmol／L劑量組的血管內(nèi)皮細(xì)胞PCNA、Ki-67表達(dá)陽性率升高，表達(dá)率約為80％，而對(duì)照組及其480～600μmol／L劑量組表達(dá)相對(duì)較弱，約為40～45％，而720～960μmol／L劑量組表達(dá)率較低僅為20％左右。 3、加氟培養(yǎng)后的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受到了一定影響，MDA、SOD及NO含量發(fā)生了變化：隨著氟濃度的逐漸升高，MDA的含量逐漸升高，NO的含量逐漸下降。SOD的含量在低濃度和作用時(shí)間不長時(shí)稍有增高，隨后開始下降， 結(jié)論 1、體外培養(yǎng)的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞其增殖速度會(huì)受多種因素的影響，我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)氟對(duì)于體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞有刺激增殖和引起損傷的雙重作用，這種作用與投氟的劑量及作用時(shí)間有關(guān)。 2、實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MDA、NO和SOD含量的變化與細(xì)胞生長狀況相關(guān)，在細(xì)胞分裂增殖和損傷中發(fā)揮重要作用。 3、氟對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用可能與氧自由基有關(guān)，具體作用機(jī)制有待下一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
[Abstract]:Purpose









The effects of different concentrations of fluorine on the growth and function of umbilical vein endothelial cells cultured in vitro were studied by means of cell culture technique , cytochemical technique , flow cytometry and related biochemical indexes . The relationship between different fluorine concentration and the activity and function of vascular endothelial cells was observed .









Materials and Methods 1 . Culture : Cultured human umbilical vein endothelial cells 304 ( HUECV - 304 ) were routinely cultured in DMEM medium containing 10 % fetal bovine serum and subjected to various experiments after passage of the cell growth state .









2 . Prepare single cell suspension density 0.8 ~ 1.0 脳 10 ~ 5 / ml , seed 24 - orifice plate , add different concentrations of sodium fluoride solution after the cell is stuck , and observe the cell growth condition and cell morphology change at 4 , 8 , 12 , 24 and 48 hours , and then count the cell count and retain the culture solution to be tested .









3 . MTT assay was used to detect cell proliferation : MTT reagent 2 渭l ( 5 mg / ml ) was added to the 96 - well cell culture plate after fluorine treatment , incubated at 37 鈩

本文編號(hào)：1938464