本文選題：李斯特菌 + 磷脂酶D　； 參考：《蘇州大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 目的 本實(shí)驗(yàn)以產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌(簡稱李斯特菌)感染Vero細(xì)胞,建立細(xì)菌侵入非吞噬細(xì)胞的模型,對李斯特菌刺激下的Vero細(xì)胞內(nèi)PLD活性變化及其對李斯特菌侵染量的影響進(jìn)行初步研究。 方法 1、將李斯特菌以不同感染比(細(xì)菌:細(xì)胞)及不同感染時間刺激Vero細(xì)胞,觀察Vero細(xì)胞內(nèi)PLD活性及李斯特菌侵染量的變化。李斯特菌的侵染量用Vero細(xì)胞內(nèi)釋放的活菌數(shù)表示。PLD的活性用在乙醇存在條件下,其催化產(chǎn)生的特異性產(chǎn)物磷脂酰乙醇在[9,10-3H]油酸標(biāo)記的磷脂類化合物總量中的百分比表示。 2、分別以PLD的不同化學(xué)抑制劑(1-丁醇及2,3-二磷酸甘油酸)預(yù)處理Vero細(xì)胞,再以李斯特菌刺激,觀察Vero細(xì)胞內(nèi)PLD活性變化對李斯特菌侵染量的影響。 3、分別用人PLD1野生型(hPLD1wt)及功能缺陷型(hPLD1-K898R)、鼠PLD2野生型(mPLD2wt)及功能缺陷型(mPLD2-K758R)的重組腺病毒預(yù)感染Vero細(xì)胞,以空白腺病毒作對照,再以李斯特菌刺激,觀察不同亞型PLD蛋白在Vero細(xì)胞內(nèi)的過量表達(dá)對李斯特菌誘導(dǎo)的胞內(nèi)PLD活性變化及李斯特菌侵染量的影響,以確定可能參與調(diào)控李斯特菌侵染Vero細(xì)胞的PLD亞型。 結(jié)果 1、在一定范圍內(nèi),李斯特菌的侵染量隨著感染比的增加(100:1、200:1、400:1)和感染時間的延長(30min、60min、120min)而升高。并且在李斯特菌內(nèi)化侵入Vero細(xì)胞的過程中確實(shí)伴有PLD的激活,與Vero細(xì)胞內(nèi)PLD的基礎(chǔ)活性相比,李斯特菌的刺激可導(dǎo)致Vero細(xì)胞內(nèi)PLD活性升高4倍左右。李斯特菌刺激不同時間后(15min到90min)Vero細(xì)胞內(nèi)的PLD活性呈現(xiàn)動態(tài)變化:與基礎(chǔ)活性相比,李斯特菌刺激15min后,PLD即顯示較高活性;隨著刺激時間的延長,PLD的活性也隨之增高,但在40min到90min之間趨于穩(wěn)定。 2、1-丁醇的預(yù)處理可導(dǎo)致李斯特菌刺激下的Vero細(xì)胞內(nèi)PLD活性顯著降低(約60%左右),并且李斯特菌的侵染量也明顯下降(約68%左右);2,3-二磷酸甘油酸的預(yù)處理同樣可導(dǎo)致李斯特菌刺激下Vero細(xì)胞內(nèi)PLD活性的降低和李斯特菌侵染量的下降。 3、4株P(guān)LD重組腺病毒可有效感染Vero細(xì)胞,并對Vero細(xì)胞內(nèi)PLD的基礎(chǔ)活性影響不大。hPLD1wt蛋白的過量表達(dá)使李斯特菌刺激下的Vero細(xì)胞內(nèi)PLD活性上升50%左右;而hPLD1-K898R和mPLD2-K758R蛋白的過量表達(dá)使李斯特菌刺激下的Vero細(xì)胞內(nèi)PLD活性下降40%左右,并且分別使李斯斯特菌的侵染量下降了51%和58%。 結(jié)論 李斯特菌誘導(dǎo)的Vero細(xì)胞對其吞噬的過程中確實(shí)伴有PLD的激活,其活性的降低對李斯特菌的內(nèi)化侵入過程有抑制作用。PLD1和PLD2兩種亞型可能均與李斯特菌刺激下的Vero細(xì)胞內(nèi)PLD的激活有關(guān),并共同參與調(diào)節(jié)李斯特菌內(nèi)化侵入Vero細(xì)胞。有關(guān)PLD在李斯特菌內(nèi)化侵入Vero細(xì)胞過程中的具體激活機(jī)制及功能有待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:Purpose






In this experiment , Vero cells were infected with listerias , and a model of non - phagocyte invasion was established . The changes of PLD activity in Vero cells under the stimulation of listeride and its effect on the infection amount were studied .






method






1 . Vero cells were stimulated with different infection ratios ( bacteria : cells ) and time of different infection times to observe the variation of PLD activity in Vero cells and the amount of listeriolyticum infection . The activity of PLD was expressed by the number of viable bacteria released in Vero cells . The activity of PLD was expressed as a percentage of the total number of phospholipid compounds labeled with 9 , 10 - 3H - oleic acid in the presence of ethanol .






2 . Vero cells were pretreated with different chemical inhibitors of PLD ( 1 - butanol and 2,3 - diphosphoglyceric acid ) . The effects of PLD activity in Vero cells on the infection rate were observed .






3 . Vero cells were pre - infected with recombinant adenovirus of human PLD1 wild type ( hPLD1 wt ) and functional defect type ( hPLD1 - K89R ) , mouse PLD2 wild - type ( mPLD2wt ) and functional defect type ( mPLD2 - K75R ) .






Results






1 . With the increase of infection ratio ( 100 鈭，

本文編號：1927488