本文選題：人類皰疹病毒8型 + Tat��； 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 本研究的目的是探索人類免疫缺陷病毒Ⅰ型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1，又稱艾滋病毒)反式激活轉(zhuǎn)錄蛋白(transactivative transcription protein，Tat)對人類皰疹病毒8型(human herpesvims 8，HHV-8)K12基因誘導(dǎo)腫瘤形成的影響及其分子機制。實驗首先構(gòu)建了含UHV-8 K12基因的重組質(zhì)粒K12-Flag-pcDNA3.1(+)(命名為pK12F)，將其與本室保存Tat-Flag-pcDNA3.1(+)(命名為pTatF)質(zhì)粒單獨或共轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞(Swiss小鼠成纖維細胞)，，同時以空載體pcDNA3.1(+)為對照，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染目的基因的四株細胞，分別命名為N／K12、N／Tat、N／K12／Tat、N／pcDNA3.1。進而采用~3HTdR摻入實驗及流式細胞檢測法分別測定上述四株細胞的增殖能力和細胞周期。~3HTdR摻入實驗結(jié)果顯示，四株細胞的增殖能力從高到低依次為N／K12／Tat、N／K12、N／pcDNA3.1、N／Tat(P＜0.05)；流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，四株細胞的S期細胞比率(S-phase fraction，SPF)從高到低的排序與~3HTdR摻入實驗結(jié)果一致。隨后，軟瓊脂集落形成實驗證實上述四株細胞均能體外誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化。將四株細胞分別進行裸鼠體內(nèi)成瘤實驗的結(jié)果表明，自分泌和近距離旁分泌Tat蛋白能加速HHV-8 K12誘導(dǎo)腫瘤的形成(Log-rank檢驗，P＜0.05)，遠距離旁分泌Tat蛋白不具備此功能(P＞0.05)。為進一步探索Tat和K12相互作用的機制，采用基因芯片技術(shù)對這四株細胞及其對應(yīng)的腫瘤組織進行了與腫瘤形成相關(guān)15條信號通路96個標志物基因mRNA表達的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然細胞和組織結(jié)果存在差異，但均顯示出Tat能促使K12基因激活更多的腫瘤信號基因。Western blot檢測四株細胞中STAT3(signal transducer and activator of transcription 3，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3)蛋白的磷酸化水平，結(jié)果顯示Tat可以促進K12激活磷酸化STAT3的表達。免疫組化檢測裸鼠腫瘤組織中CyclinD1(周期蛋白D1)、VEGF(vascular endothelial growth factor，血管內(nèi)皮細胞生長因子)和Survivin(存活素)的結(jié)果表明Tat能降低這些蛋白在K12誘導(dǎo)的腫瘤中的表達。 本研究結(jié)果提示，在體外Tat能增強K12轉(zhuǎn)化細胞的增殖能力；裸鼠體內(nèi)成瘤實驗中自分泌和近距離旁分泌Tat蛋白均能加速HHV-8 K12誘導(dǎo)腫瘤的形成；STAT3信號通路是參與Tat加速K12誘導(dǎo)腫瘤生成的腫瘤信號通路之一；同時Tat降低了VEGF、CyclinD1、Survivin在K12誘導(dǎo)腫瘤中的表達。
[Abstract]:The aim of this study was to investigate the effect of transactivative transcription protein (Tatatt) of human immunodeficiency virus type I (HIV-1) transactivated transcription protein on tumorigenesis induced by HHV-8K12 gene of human herpesvirus 8 (HHV-8) and its molecular mechanism. Firstly, a recombinant plasmid K12-Flag-pcDNA3.1 containing UHV-8 K12 gene was constructed. The four cells stably transfected with the target gene were named N / K12N / T / T / N / K 12 / T / pcDNA3.1, respectively. The proliferative ability and cell cycle of the four cell lines were measured by 3HTdR incorporation assay and flow cytometry, respectively. The results showed that the proliferative ability of the four cell lines was N / K 12 / TatK 12 / T K12N / pc3.1N / T T (P < 0.05), and the results of flow cytometry showed that the proliferation ability of the four cell lines was higher than that of the control group (P < 0.05), and the results of flow cytometry showed that the proliferative ability of the four cell lines was N / K 12 / Tatr / N% pc3.1N / T T (P < 0.05). The S phase ratio of S phase fractionated SPFs from high to low was consistent with the results of 3HTdR incorporation. Subsequently, the soft Agar colony formation assay confirmed that all the above four cell lines could induce cell transformation in vitro. The results of tumorigenesis in nude mice showed that autocrine and close paracrine Tat protein could accelerate the formation of tumor induced by HHV-8 K12 (P < 0.05), but the long-distance paracrine Tat protein did not have this function (P > 0.05). In order to further explore the mechanism of interaction between Tat and K12, the gene mRNA expression of 96 markers related to tumor formation in these four cell lines and their corresponding tumor tissues were detected by gene chip technique. It was found that although there were differences in cell and tissue outcomes, The results showed that Tat could induce K12 gene to activate more tumor signal genes. Western blot was used to detect the phosphorylation level of STAT3(signal transducer and activator of transcription 3, signal transduction and transcription activator 3 in four cell lines. The results showed that Tat could promote the expression of phosphorylated STAT3 activated by K12. The expression of cyclin D 1 (cyclin D 1) and survivin (survivin) in tumor tissues of nude mice was detected by immunohistochemistry. The results showed that Tat could decrease the expression of these proteins in K12 induced tumor. The results suggest that Tat can enhance the proliferation of K12 transformed cells in vitro. Autocrine and close paracrine Tat protein can accelerate tumor formation induced by HHV-8 K12 in nude mice. STAT3 signaling pathway is one of the tumor signaling pathways involved in Tat accelerating K12 induced tumor formation. At the same time, Tat decreased the expression of VEGF cyclin D 1 survivin in K 12 induced tumor.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R373;R730.2

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本文編號：1920787