本文選題：人單純皰疹病毒2型 + 啟動(dòng)子ICP10�。� 參考：《青島大學(xué)》2005年碩士論文

【摘要】：目的 建立以加強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)為報(bào)告基因檢測(cè)人單純皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV)感染的細(xì)胞株。 方法 提取HSV-2 DNA,利用DNA Star軟件設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)于HSV-2(Sal 5株)ICP10啟動(dòng)子的PCR引物,引入BgI Ⅱ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增目的基因片段,將回收純化的PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T載體構(gòu)建亞克隆,切下目的基因,連接至真核表達(dá)載體pEGFP-1構(gòu)建重組質(zhì)粒pICP10-EGFP,經(jīng)雙酶切和DNA測(cè)序鑒定后,以陽(yáng)離子脂質(zhì)體法(Lipofectamine2000)轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后,加入G418(400μg/ml)篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆,進(jìn)行放大培養(yǎng)建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株Vero-ICP10-EGFP細(xì)胞。以不同量的HSV-2感染Vero-ICP10-EGFP細(xì)胞,分別于感染后6h、8h、10h,以倒置熒光顯微鏡檢測(cè)GFP熒光。 結(jié)果 經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得641bp大小的目的基因片段,構(gòu)建的重組質(zhì)粒pICP10-EGFP經(jīng)雙酶切及DNA測(cè)序鑒定,表明重組正確。重組質(zhì)粒pICP10-EGFP轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后,以G418篩選11天出現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞克隆,建立的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株Vero-ICP6-EGFP細(xì)胞經(jīng)HSV-2誘導(dǎo)感染,最早于6h即可在倒置熒光顯微鏡下檢測(cè)到GFP綠色熒光,隨著時(shí)間的增加,GFP熒光的量及強(qiáng)度逐漸增加。 結(jié)論 本研究建立的以EGFP為報(bào)告基因的Vero-ICP6-EGFP細(xì)胞株具有早期、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn),特異性較高,進(jìn)一步完善后有望用于HSV-2感染的快速診斷及抗病毒藥物的篩選。
[Abstract]:Objective to establish a cell line with enhanced green fluorescent protein (EGFP) as a reporter gene for detection of human herpes simplex virus (HSV) infection. Methods HSV-2 DNA was extracted and PCR primers corresponding to HSV-2(Sal 5 strains ICP10 promoter were designed by DNA Star software. BgI 鈪，

本文編號(hào)：1908699