本文選題：RPK118 + PRDX3��； 參考：《復(fù)旦大學(xué)》2005年博士論文

【摘要】：由于發(fā)現(xiàn)我室1999年報道的RPS6KC1基因在肝癌組織中上調(diào)表達(dá),我們擬對其生理功能進(jìn)行詳細(xì)研究,但在核對測序數(shù)據(jù)時卻發(fā)現(xiàn)其cDNA序列并非是全長序列,于是通過EST電子信息步移的方法,在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索到了若干位于5’側(cè)的新ESTs序列,經(jīng)重新拼接得到的全長cDNA序列長達(dá)4196bp,較之原序列(2349bp)長了1847bp,與原先Northem雜交檢測到的轉(zhuǎn)錄本長度4.4kb非常接近。新序列的開放閱讀框為3102bp,它編碼了1066個氨基酸,預(yù)測蛋白分子量為118.7KD。用全長cDNA檢索人類基因組序列發(fā)現(xiàn),該基因由15個外顯子和14個內(nèi)含子組成,位于染色體1q32.3,我們從人腦cDNA文庫中克隆到了全長的RPS6KC1 cDNA,測序證明所克隆的cDNA與來自ESTS拼接的序列完全一致。經(jīng)用SMART軟件作RPS6KC1功能結(jié)構(gòu)域分析,發(fā)現(xiàn)預(yù)測的RPS6KC1具有4個結(jié)構(gòu)域,依次它們分別是PX結(jié)構(gòu)域(PX domain)、MIT結(jié)構(gòu)域(Microtubule-Interacting and Trafficking moleculars domain)、STK1和STK2結(jié)構(gòu)域(Serine/Threonine protein kinases,catalytic domain)。 為了證明RPS6KC1蛋白的客觀存在并為進(jìn)一步研究該蛋白的功能提供材料,我們在原核細(xì)胞中重組表達(dá)了RPS6KC1表位抗原區(qū)的肽段,并用其制備了RPS6KC1的多克隆抗體。Westem Blot證實RPS6KC1確實存在于細(xì)胞中,其分子量約為120KD�；陬A(yù)測的RPS6KC1具有間隔分布的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域,我們又用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)了RPS6KC1的全蛋白,并以MBP(Myline Binding Protein)以及S6肽段為底物,檢測了RPS6KC1的蛋白激酶活性,但未能獲得陽性結(jié)果。由于這一實驗結(jié)果與日本學(xué)者在同期獲得的研究結(jié)果一致,我們采納了日本學(xué)者對這個基因的命名(2002年9月發(fā)表于JBC),RPK118(既118KD的核糖體假激酶)。 雖然RPK118蛋白沒有激酶活性,但日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)它能夠與鞘氨醇激酶互作,并且可共定位于內(nèi)涵體上,非常巧合的是我們用酵母雙雜交、Pull-Down和免疫共沉淀等方法發(fā)現(xiàn)PRK118能夠與一個已知定位于線粒體的抗氧化蛋白PRDX3互作,并且它也能把PRDX3共定位到內(nèi)涵體上。在293T和COS7細(xì)胞中,熒光抗體標(biāo)記的RPK118彌散分布、或者成小環(huán)狀、顆粒狀分布于細(xì)胞質(zhì)中,與早期內(nèi)涵體標(biāo)志蛋白EEA1呈現(xiàn)共定位圖像。在RPK118與PRDX3共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,RPK118的分布與單獨轉(zhuǎn)染時相同,而PRDX3與EEA1呈現(xiàn)明確的共定位圖像,這在單獨轉(zhuǎn)染PRDX3時很難觀察到。然而,當(dāng)用缺失N端PX區(qū)的RPK118突變體與PRDX3共轉(zhuǎn)染時,二者顯現(xiàn)共定位圖像,但都不能與EEA1共定位。當(dāng)用缺失C端激酶區(qū)的RPK118突變體與PRDX3共轉(zhuǎn)染時,則僅見RPK118與EEA1的共定位,觀察不到PRDX3與EEA1的共定位。這些結(jié)果提示,RPK118的PX結(jié)構(gòu)域是參與內(nèi)涵體定位的區(qū)域,而其激酶結(jié)構(gòu)域可能是PRDX3的
[Abstract]:Due to the discovery of the up-regulation of RPS6KC1 gene expression in HCC tissues reported in our laboratory in 1999, we intend to study its physiological function in detail, but when we check the sequencing data, we find that its cDNA sequence is not a full-length sequence. A number of new ESTs sequences located on the 5'side were retrieved in the GenBank database by the method of EST electronic information step. The full-length cDNA sequence was 4196bp, 1847 BP longer than the original sequence 2349bp, which was very close to the length 4.4kb detected by Northem hybridization. The open reading frame of the new sequence is 3102 BP, which encodes 1066 amino acids, and the predicted molecular weight of the protein is 118.7 KD. Searching the human genome sequence by full-length cDNA, we found that the gene consists of 15 exons and 14 introns. At chromosome 1q32.3. the full-length RPS6KC1 cDNA was cloned from the human brain cDNA library. The sequence of the cloned cDNA was identical to the sequence from the ESTS splicing. By using SMART software to analyze the functional domain of RPS6KC1, it is found that the predicted RPS6KC1 has four domains, which are PX domain PX domain, Microtubule-Interacting and Trafficking moleculars domain STK1 and STK2 domain Serine / Threonine protein kinasescattic domain respectively, which are respectively microtubule-interacting and Trafficking moleculars domain STK1 and STK2 domain Serine / Threonine protein kinasescatalytic domain. In order to prove the existence of RPS6KC1 protein and provide materials for further study of its function, we expressed the peptide of RPS6KC1 epitope in prokaryotic cells. The polyclonal antibody of RPS6KC1. Westem Blot showed that RPS6KC1 existed in the cells, and its molecular weight was about 120kD. Based on the predicted protein kinase domain of RPS6KC1, we expressed the whole protein of RPS6KC1 in mammalian cells and detected the protein kinase activity of RPS6KC1 using MBP(Myline Binding protein and S6 peptide as substrates, but no positive results were obtained. As the results of this study are consistent with those obtained by Japanese scholars in the same period, we have adopted the name of this gene by Japanese scholars (published in September 2002 in JBCX RPK118, the ribosomal pseudokinase of 118KD. Although the RPK118 protein has no kinase activity, Japanese researchers have found that it can interact with sphingosine kinase and co-locate on the connotations. Coincidentally, we found that PRK118 can interact with an antioxidant protein known to be located in mitochondria, PRDX3, by yeast two-hybrid pull-down and immunoprecipitation, and it can also co-locate PRDX3 on the connotative body. In 293T and COS7 cells, fluorescent antibody labeled RPK118 was dispersed, or formed a small circular, granular distribution in the cytoplasm, showing a co-localization image with the early connotative marker protein EEA1. The distribution of RPK118 in the co-transfected cells of RPK118 and PRDX3 was the same as that in the single transfection, while PRDX3 and EEA1 showed a clear co-localization image, which was difficult to observe when PRDX3 was transfected alone. However, when the RPK118 mutants with missing N-terminal PX region were co-transfected with PRDX3, the co-localization images were displayed, but neither of them could be co-located with EEA1. When the RPK118 mutant with missing C-terminal kinase region was co-transfected with PRDX3, only the co-localization of RPK118 and EEA1 was observed, but the co-localization of PRDX3 and EEA1 was not observed. These results suggest that the PX domain of RPK118 is the domain involved in the localization of intension, and its kinase domain may be PRDX3's.
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R346;Q987

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本文編號：1899721