本文選題：p38絲裂原活化蛋白激酶 + p53��； 參考：《第一軍醫(yī)大學》2007年博士論文

【摘要】： 細胞凋亡在腫瘤發(fā)生、胚胎發(fā)育、免疫反應、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和組織細胞代謝等過程中起重要作用。凋亡失調是當今威脅人類健康的許多重大疾病的重要發(fā)病機制之一。例如，細胞凋亡異常在許多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著至關重要的作用。然而，盡管目前對于凋亡調控機制的研究已經(jīng)相當深入，但存在著許多研究結果相互矛盾的現(xiàn)象，這極大地影響了腫瘤的基礎研究與臨床治療。因此，有必要探討這些相互矛盾的結果，從而在腫瘤的基礎研究領域取得突破，來服務于臨床腫瘤治療。 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是信號從細胞表面?zhèn)鲗У郊毎藘炔康闹匾獋鬟f者。p38是4個MAPK亞族之一，主要參與應激與炎癥反應。研究表明，p38 MAPK還參與細胞惡性轉化和腫瘤細胞浸潤轉移等病理過程，其對細胞周期和凋亡的調控是其生物學功能的重要方面。在不同細胞類型、不同刺激種類或強度的情況下，p38 MAPK活化所導致的細胞生物學效應可能有所不同，有時甚至完全相反。另外，當使用的研究方法不同時，得出的結果可能也大相徑庭。例如，以往的大量研究都表明，在多種刺激下，p38被磷酸化激活來介導細胞凋亡。但也有報道在某些情況下p38對細胞凋亡具有保護作用。因此，p38 MAPK的活化到底是促進凋亡還是抑制凋亡，目前尚存在爭議。 腫瘤抑制基因p53是目前研究最為廣泛和系統(tǒng)的抑癌基因之一。野生型p53參與了DNA損傷修復、細胞周期調控、細胞凋亡及抑制血管生成等過程。p53基因的突變使上述功能喪失，從而導致腫瘤的形成。盡管一般認為p53的活化主要導致細胞周期抑制和細胞凋亡，從而發(fā)揮其“分子警察”的作用，但也有研究表明，p53的活化在某些情況下對細胞具有保護作用，使細胞免于死亡。這提示p53信號通路的活化除了可以導致生長抑制和凋亡，也可以通過激活與生存相關的信號通路，從而在受到DNA損傷刺激時來維持細胞存活和死亡之間的平衡。因此，p53活化的最終結果是導致細胞凋亡還是細胞存活，可能也與刺激形式、強度、作用時間以及細胞類型有關。 大量研究表明，p38 MAPK與p53在調控細胞凋亡中具有重要的功能聯(lián)系。例如，在正常的人類角質細胞中，中波紫外線(ultraviolet radiation B，UVB)刺激可使p38激活，隨后活化的p38在Ser~(15)位點磷酸化p53。這種p38依賴的磷酸化導致p53在細胞質中積聚，從而阻止了p53轉位入核，發(fā)揮對紫外線誘導的細胞死亡的保護作用。而在兔關節(jié)軟骨中，一氧化氮誘導活化的p38可磷酸化p53的Ser~(15)位點，引起p53蛋白的積聚并導致凋亡。這些結果提示p38 MAPK對p53的磷酸化激活既可能導致細胞凋亡，也可能使細胞存活。另外，不但p38 MAPK可磷酸化激活p53，p53也可以通過其轉錄活性的調節(jié)來反作用于p38 MAPK。例如，Wip1可能是以一種負反饋(negative feedback)的方式來調控p38-p53信號通路，從而防止該信號通路的過度激活。 盡管p38 MAPK和p53在細胞凋亡中都具有重要作用的觀點已被廣泛接受，但兩者在細胞凋亡調控中的確切作用仍存在著不同觀點，這可能是由于采用的研究方法、系統(tǒng)和細胞系不同的緣故�；蚯贸鳛橐环N重要的蛋白質功能研究手段，其結果較其它方法更為可靠，對于闡明蛋白質的功能具有結論性的作用。因此，為了澄清p38 MAPK和p53在細胞凋亡中的作用和兩者之間的功能聯(lián)系，有必要利用p38 MAPK或p53基因敲除細胞來闡明其在不同刺激條件下的確切生理功能。 在本研究中，我們選取紫外線(ultraviolet，UV)照射作為刺激因素，首先研究了p38 MAPK受到UV照射后磷酸化激活的動力學過程，結果發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK在受到UV刺激后30 min即顯著激活，約60 min～120 min達到峰值，刺激后240min又回到靜息水平。與p38 MAPK不同的是，p53受到UV刺激后15 min即開始激活，約60 min時達到峰值，然后保持持續(xù)激活的狀態(tài)，而并不回到初始水平。這說明p38 MAPK與p53的磷酸化激活具有不同的細胞動力學過程。 為了進一步明確在細胞受到UV刺激的情況下，p38 MAPK是否能夠介導p53的磷酸化，我們利用p38 MAPK特異性抑制SB203580預處理阻斷p38 MAPK細胞信號通路，觀察其對p53磷酸化的影響。結果發(fā)現(xiàn)，，p38 MAPK及其下游底物激活轉錄因子2(activator transcription factor-2，ATF-2)能被磷酸化激活，雖然SB203580的預處理對于p38 MAPK的磷酸化并沒有抑制，但的確阻斷了p38的激酶活性。同時觀察到，UV也能刺激p53磷酸化，且SB203580的預處理并沒有能夠阻斷p53的Ser~(15)磷酸化。這說明UV刺激時p53的磷酸化不是由p38MAPK介導，提示兩者可能通過不同機制來介導UV刺激誘導的細胞反應。 利用Western blot和免疫熒光染色驗證了我們所使用的p38 MAPK基因敲除(gene knockout)小鼠胚胎成纖維細胞(murine embryonic fibroblast，MEF)p38~(-／-)細胞中p38 MAPK基因確實被成功敲除后，我們進一步觀察了p38 MAPK基因敲除對UV誘導的p53磷酸化的影響。結果表明，在UV刺激時，表達p38的p38~(+／+)細胞和不表達p38的p38~(-／-)細胞中的p53都能顯著地被磷酸化激活，說明p38 MAPK基因敲除對于UV刺激誘導的p53磷酸化并沒有阻斷效應，證實了在UV刺激時p38 MAPK確實不是介導p53 Ser~(15)磷酸化的主要激酶。 觀察到p38 MAPK基因敲除對于UV刺激誘導的p53磷酸化并沒有阻斷效應后，我們進一步研究了p38基因敲出的p38~(-／-)細胞中UV誘導的p53移位入核過程是否被阻斷。結果表明，p38~(-／-)細胞中，未受刺激時p53的細胞內分布與p38~(+／+)細胞類似，而受到UV刺激后不但UV誘導的p53磷酸化沒被阻斷，而且其激活后的移位入核過程也未受影響。 利用Western blot和免疫熒光染色驗證了我們所使用的p53基因敲除的MEF細胞(p53~(-／-))中p53基因確實被成功敲除后，我們進一步觀察了p53基因敲除對UV誘導的p38 MAPK磷酸化的影響。結果表明，在UV刺激時，p53~(+／+)細胞和p53~(-／-)細胞中的p38 MAPK都能較刺激前顯著地被磷酸化激活，證實p53基因敲除對于UV刺激誘導的p38 MAPK的磷酸化也沒有影響。 觀察到p53基因敲除對于UV刺激誘導的p38 MAPK磷酸化并沒有阻斷效應后，我們進一步研究了p53~(-／-)細胞中UV誘導的p38 MAPK移位入核過程是否被阻斷。結果發(fā)現(xiàn)，未受刺激時p38 MAPK在p53~(-／-)細胞與p53~(+／+)細胞中的分布類似，而受到UV刺激后，在p53~(-／-)細胞UV誘導的p38 MAPK磷酸化并沒被阻斷，而且其激活后的移位入核過程也未受影響。 我們進一步驗證UV刺激是否誘導p38 MAPK與p53有物理學上的相互作用。利用基因共轉染，進行免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)實驗，結果發(fā)現(xiàn)，無論受到UV刺激與否，兩者都沒有發(fā)生相互作用。 我們隨后研究了p53和p38 MAPK基因敲除對UV誘導的細胞凋亡的影響。我們首先利用熒光顯微鏡對于凋亡細胞進行了形態(tài)學上的觀察。結果發(fā)現(xiàn)，在靜息狀態(tài)下，p38~(+／+)細胞的核染色均勻一致，而p38~(-／-)細胞有少數(shù)細胞已有核濃染的現(xiàn)象。UV刺激后，p38~(+／+)細胞核仍然表現(xiàn)為形態(tài)清楚，沒有明顯改變，而部分p38~(-／-)細胞產(chǎn)生了典型的凋亡細胞形態(tài)學變化，即胞質濃縮以及核濃染、邊緣化和碎裂。在靜息狀態(tài)下，p53~(+／+)細胞和p53~(-／-)細胞的核染色都均勻一致。UV刺激時，p53~(+／+)細胞核仍然表現(xiàn)為形態(tài)清楚，沒有明顯改變，而部分p53~(-／-)細胞產(chǎn)生了典型細胞凋亡的形態(tài)學變化。這說明p38 MAPK和p53對于UV誘導的細胞凋亡都具有保護作用。 在形態(tài)學上觀察了p53或p38 MAPK基因敲除對UV誘導的細胞凋亡的影響后，我們通過流式細胞儀對細胞凋亡情況進行了定量分析。我們首先研究了p38 MAPK基因敲除對UV誘導的細胞凋亡的影響。結果表明，p38~(-／-)細胞刺激后的凋亡率與刺激前相比明顯增加(P＜0.01)，與p38~(+／+)細胞刺激后的凋亡率相比也有明顯增加(P＜0.01)。我們隨后又研究了p53基因敲除對UV誘導的細胞凋亡的影響。結果表明，p53~(-／-)細胞刺激后的凋亡率與刺激前相比明顯增加(P＜0.01)，與p53~(+／+)細胞刺激后的凋亡率相比也有明顯增加(P＜0.01)。這說明p38 MAPK或p53基因敲除可使UV誘導的細胞凋亡數(shù)量增加。 我們隨后又觀察了SB203580預處理對UV誘導的p53或p38 MAPK基因敲除細胞凋亡的影響。結果表明，在SB203580預處理時，p38~(+／+)細胞刺激后的凋亡率與刺激前相比明顯增加(P＜0.01)，p38~(-／-)細胞刺激后的凋亡率與刺激前相比也有明顯增加(P＜0.01)，但p38~(+／+)細胞與p38~(-／-)細胞之間刺激后的凋亡率沒有明顯差異。同時，p53~(+／+)細胞刺激后的凋亡率與刺激前相比明顯增加(P＜0.05)，p53~(-／-)細胞刺激后的凋亡率與刺激前相比也有明顯增加(P＜0.01)。而且，單獨的SB203580預處理時，p53~(-／-)細胞的凋亡率較p53~(+／+)細胞明顯增加(P＜0.05)；當SB203580預處理后，再使用UV刺激，p53~(-／-)細胞與p53~(+／+)細胞相比凋亡率也明顯增加(P＜0.01)。上述結果提示單獨的p38 MAPK基因敲除或p53基因敲除都使細胞在受到UV刺激時易于凋亡，而且兩者的功能具有疊加效應，進一步證實在特定條件下兩者對于細胞都具有保護作用。 盡管p38 MAPK與p53都能對UV刺激誘導的細胞凋亡具有保護作用，但由于兩者在激活的動力學過程、相互之間的激活、激活后的移位以及相互作用等方面都沒有功能上的聯(lián)系，因此應當是通過不同細胞信號機制來介導對細胞的保護作用。 總之，本實驗主要利用免疫印跡(immunoblotting)、免疫熒光染色(immuno-fluorescence staining)、核形態(tài)學(nuclear morphology)觀察及流式細胞術(flow cytometry)等技術研究了p38 MAPK與p53在低劑量UV刺激時的激活、移位、相互作用以及凋亡之間的關系，并進一步探討兩者在UV誘導凋亡時對細胞保護作用的可能機制，得出了以下結論： 1．p38 MAPK與p53在UV刺激時激活的動力學過程具有不同的特點； 2．抑制p38 MAPK或其功能缺失對于UV誘導的p53磷酸化激活和激活后移位沒有影響； 3．p53功能抑制對于UV誘導的p38 MAPK磷酸化激活和激活后移位沒有影響； 4．p38 MAPK和p53對于UV刺激誘導的細胞凋亡都具有保護作用，且兩者的作用具有疊加效應； 5．p38 MAPK和p53通過互不依賴的信號機制來介導對UV刺激誘導的細胞凋亡的保護作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第一軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R363

【引證文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 徐全壹;“寒淫”致病及轉歸的轉錄組與代謝組實驗研究[D];成都中醫(yī)藥大學;2012年

相關碩士學位論文 前2條

1 俞璐;耐力運動對不同月齡ICR小鼠P53/SCO1/SCO2基因表達的影響[D];華東師范大學;2011年

2 孫曉娟;黃精、巴戟天、白芷有效成分體外抗腫瘤作用的研究[D];鄭州大學;2012年

本文編號：1890356