發(fā)布時間：2018-05-12 00:00

  本文選題：肝細胞生長因子受體 + 單鏈抗體�。� 參考：《細胞與分子免疫學(xué)雜志》2014年09期

【摘要】：目的構(gòu)建可表達抗人肝細胞生長因子受體(HGFR)單鏈抗體(scFv)的慢病毒表達載體,將其感染HEK293細胞,檢測該抗體的表達及與抗原結(jié)合活性。方法采用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)從分泌小鼠抗人HGFR抗體的雜交瘤細胞株(8E8)中擴增VH和VL基因,用重疊延伸PCR法將VH和VL進行拼接,得到含有信號肽SP-VH-linker-VL的單鏈抗體基因(HGFR-scFv),將其插入克隆載體pCR-Blunt中。用內(nèi)切酶將HGFR-scFv基因從pCR-Blunt上切下,插入慢病毒載體pRRL-CMV中,經(jīng)相應(yīng)酶切和測序鑒定,正確構(gòu)建慢病毒表達載體pRRL HGFR-scFv。磷酸鈣法轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,48 h后通過熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白(GFP)的表達,將獲得病毒顆粒進一步感染HEK293細胞,RT-PCR和ELISA檢測scFv的表達情況。結(jié)果抗人HGFRscFv的慢病毒表達載體構(gòu)建成功,病毒顆粒感染HEK293細胞后,得到了可以穩(wěn)定表達抗人HGFR-scFv的細胞系;ELISA結(jié)果表明,scFv能與人HGFR特異性結(jié)合。結(jié)論成功克隆了小鼠抗人HGFR抗體的scFv基因,并構(gòu)建其慢病毒表達系統(tǒng)。
[Abstract]:Objective to construct a lentivirus expression vector which can express anti-human hepatocyte growth factor receptor (HGFR) single-chain antibody (scFv), and to detect its expression and antigen-binding activity in HEK293 cells. Methods VH and VL genes were amplified by reverse transcription PCR RT PCR from hybridoma cell line 8 E8 which secreted anti-human HGFR antibody. VH and VL were spliced by overlapping extension PCR. A single chain antibody gene (HGFR-scFv1) containing signal peptide SP-VH-linker-VL was obtained and inserted into the cloned vector pCR-Blunt. HGFR-scFv gene was digested from pCR-Blunt by endonuclease and inserted into lentivirus vector pRRL-CMV. The lentivirus expression vector pRRL HGFR-scFv was correctly constructed by restriction endonuclease digestion and sequencing. After transfection of HEK293T cells with calcium phosphate for 48 h, the expression of green fluorescent protein (GFP) was detected by fluorescence microscope. The viral particles were further infected with HEK293 cells by RT-PCR and ELISA to detect the expression of scFv. Results the lentivirus expression vector against human HGFRscFv was successfully constructed. After the virus particles were infected with HEK293 cells, a cell line capable of stably expressing anti-human HGFR-scFv was obtained by Elisa. The results showed that SSCFv could specifically bind to human HGFR. Conclusion the scFv gene of mouse anti-human HGFR antibody was cloned successfully and its lentivirus expression system was constructed.
【作者單位】： 蘇州市立醫(yī)院東區(qū)檢驗科;同濟大學(xué)蘇州研究院生物醫(yī)藥中心;
【基金】：江蘇省自然科學(xué)基金(BK2012162) 蘇州市科技發(fā)展計劃(SYG201131) 蘇州市生物新藥創(chuàng)制重點實驗室(SZS201002)
【分類號】：R392.11

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本文編號：1876191