本文選題：基因疫苗 + 免疫耐受　； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2007年博士論文

【摘要】： 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是嚴(yán)重危害人類身體健康并影響勞動力的慢性全身性多發(fā)性、常見性自身免疫性疾病。國際上總患病人數(shù)約為6000萬-1.1億，我國總患病人數(shù)也逾400-600萬左右。僅就美國而言，僅2000年一年耗費(fèi)在骨關(guān)節(jié)炎醫(yī)療、保健和勞資方面造成的經(jīng)濟(jì)損失就高達(dá)14904億美元。針對國際社會RA發(fā)病率和致殘率日益增多的嚴(yán)峻形勢，WHO于2000年向全世界提出了“骨與關(guān)節(jié)10年”計(jì)劃，號召要“大力開展對骨關(guān)節(jié)病預(yù)防、診斷和治療的研究”以及“不斷開發(fā)和應(yīng)用有改變病情效果并減少副作用的藥物”。因此，深入研究RA的發(fā)病機(jī)制、治療藥物及其治療方案就顯得尤為重要和迫切。鑒于RA病人的滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞變形與免疫功能的改變密切相關(guān)，自上世紀(jì)九十年代以來國際上對RA新的免疫治療策略進(jìn)行了廣泛深入探索。其中基因或DNA治療性疫苗就是最受關(guān)注和推崇的策略之一，也是近年來免疫學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)界研究最活躍、最富有成效的領(lǐng)域之一。在短短不到十年的發(fā)展歷程中卻已取得了舉世注目的進(jìn)展。目前國際上至少已有四個不同的基因治療性疫苗獲批進(jìn)行臨床Ⅰ/Ⅱ?qū)嶒?yàn)。然而，目前國際上探索用于RA研究的DNA疫苗僅限于T細(xì)胞疫苗或T細(xì)胞肽疫苗以及TCR疫苗，尚無針對特異性抗原的治療性疫苗。 業(yè)已證實(shí)，Ⅱ型膠原是人類RA最關(guān)鍵的自身抗原之一，在RA患者的血清及關(guān)節(jié)腔中均可發(fā)現(xiàn)大量的抗Ⅱ型膠原抗體和自身反應(yīng)性T細(xì)胞。據(jù)此，我們在國際上首先原創(chuàng)性地提出研制基于雞Ⅱ膠原蛋白(CCII)耐受原表位能有效治療RA的新型DNA Tolerizing治療性疫苗的設(shè)想，我們前期的初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了該思路的科學(xué)性和實(shí)踐的可行性。其堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)在于：1)．美國科學(xué)家首次發(fā)明“口服耐受”治療策略，并且采用CCII治療某些RA患者獲得肯定療效。該研究結(jié)果發(fā)表《Science》上，目前歐美發(fā)達(dá)國家整的進(jìn)行口服耐受CCII治療RA的Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)研究；2)．歷經(jīng)長期不懈努力，我們在國際上首次克隆成功編碼CCOL2A1全長基因，首先申報(bào)了中國發(fā)明專利，專利申請?zhí)枮椋?2149375.8；隨后又申報(bào)了國際PCT發(fā)明專利，專利申請?zhí)枮镻CT/CN03/0096，新近國際局作出“專利性國際初步報(bào)告”表明：支持PCT/CN03/00967所提出的1-10全部條款的新穎性、創(chuàng)造性和工業(yè)實(shí)用性的權(quán)利要求，并于2006年5月14日前進(jìn)入美、英、德、法、日五國國家階段。由此為我們原創(chuàng)性研制成功能有效治療RA的新型基因Tolerizing治療性疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)和保障。本課題是將口服免疫耐受與基因治療性疫苗兩大策略充分進(jìn)行有機(jī)結(jié)合以期創(chuàng)新性研制全新型DNA Tolerizing治療性疫苗，通過RA動物模型系統(tǒng)評價該疫苗的體內(nèi)治療療效，并探索該疫苗療效的作用機(jī)制尤其是T細(xì)胞耐受機(jī)制。 勿庸置疑，本研究的關(guān)鍵是能否構(gòu)建成功在真核細(xì)胞中高效表達(dá)的CCOL2A1基因疫苗。鑒于我們前期的工作已將CCOL2A1基因構(gòu)建于原核表達(dá)載體中，為此，我們根據(jù)真核表達(dá)載體pcDNA3.1上的酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和HindⅢ以及CCOL2A1全長cDNA上的信號肽序列設(shè)計(jì)引物，同時還在引物上添加了Kozak序列和信號肽序列，PCR擴(kuò)增測序正確后連接到pcDNA3.1上，即獲得本實(shí)驗(yàn)所需要的基因疫苗pcDNA3.1-CCOL2A1。為了檢證所構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-CCOL2A1能否在體外有效地表達(dá)，我們將其轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞(10~6)中。經(jīng)G418篩選后，培養(yǎng)陽性克隆，收獲、濃縮、真空干燥培養(yǎng)液，然后再溶解在0.1 mol／L的乙酸中。產(chǎn)物經(jīng)15％SDS-PAGE電泳檢測，在143kD左右處可見一電泳條帶，經(jīng)Western-Blot分析證明，在約143kD左右亦可見到特異性反應(yīng)條帶，與質(zhì)粒pcDNA3.1-CCOL2A1基因表達(dá)的CCII蛋白相對應(yīng)。而僅轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的細(xì)胞培養(yǎng)液中則沒見特異性條帶出現(xiàn)。由此證明pcDNA3.1-CCOL2A1能在COS-7細(xì)胞中有效表達(dá)CCII多肽鏈的α亞單位，而且是分泌型表達(dá)。 我們知曉，膠原蛋白的表達(dá)是一個非常復(fù)雜的過程，涉及到翻譯后加工、糖基化、羥基化等多種步驟，至少需要8種酶的參與，其中脯氨酸羥化酶P4Hα、β兩個亞基的羥基化作用尤為重要，它能特異的使膠原三肽重復(fù)序列Gly-X-pro中的脯氮酸殘基羥基化。而羥化脯氨酸對于在生理?xiàng)l件下形成穩(wěn)定的膠原三螺旋結(jié)構(gòu)是必需的，并且P4H的活性與膠原的合成呈平行關(guān)系，膠原表達(dá)量的提高有賴于P4H與其的共表達(dá)。為了驗(yàn)證我們所構(gòu)建的基因疫苗pcDNA3.1-CCOL2A1所表達(dá)的CCII是否是羥基化的氨基酸，我們采用MALDI-TOF-MS進(jìn)行了相關(guān)分析。將SDS-PAGE中特異性條帶切割下來，，經(jīng)過膠內(nèi)酶切后進(jìn)行肽質(zhì)量指紋譜的鑒定，然后選取肽段進(jìn)行ESI-MS/MS分析。串聯(lián)質(zhì)譜圖經(jīng)Micromass專用軟件MaxEnt3處理后，用Spectrum通過Mascot查淘NCBI、SWISSPROT等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果證明該產(chǎn)物的確為alpha 1 typeⅡprocollagen[Gallus gallus]，即雞Ⅱ型膠原蚩白α鏈；其中脯氨酸(Pro)未被修飾，m/z為416.19。由此提示，基因疫苗pcDNA3.1-CCOL2A1所表達(dá)的CCII至少有部分沒有被羥基化，因?yàn)槲覀兯暨x的肽段中的脯氨酸并沒有被羥基化。 那么，這種缺乏脯氨酸羥化酶P4Hα、β的pcDNA-CCOL2A1基因疫苗所表達(dá)的產(chǎn)物是否具有生物學(xué)功能?尤其是在RA大鼠體內(nèi)能否誘導(dǎo)有效的免疫耐受?則是我們最為關(guān)注的大問題。因此我們采用天然CCII在Wistar大鼠中建立了標(biāo)準(zhǔn)的CIA大鼠RA模型。CIA的發(fā)病率高達(dá)73％(45/62)。經(jīng)四肢關(guān)節(jié)腫脹程度評分、放射影象學(xué)和組織病理學(xué)驗(yàn)證，該模型與文獻(xiàn)報(bào)道的一致，完全符合CIA大鼠RA模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)治療的標(biāo)準(zhǔn)要求。我們的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，空載體組和20μg/kg基因疫苗治療組對CIA大鼠四肢關(guān)節(jié)腫脹程度無任何治療作用；200μg/kg基因疫苗治療組可明顯減輕四肢關(guān)節(jié)腫脹程度，與其他所有組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P＜0.05)，尤其是與目前臨床上用于治療RA病人的“金標(biāo)準(zhǔn)”治療MTX組的療效幾近相同；而400μg/kg高劑量基因疫苗組卻可使關(guān)節(jié)炎指數(shù)略有升高。隨后的組織病理學(xué)檢查及其評分結(jié)果顯示，注射200μg/kg pcDNA3.1對照組其后足有明顯的血管翳形成，滑膜增生和大量淋巴細(xì)胞浸潤，關(guān)節(jié)軟骨變薄且失去完整性，幾乎觀察不到完整的骨小梁，骨髓腔部為分布有大量破骨細(xì)胞；20μg／kg及400μg／kg治療組與關(guān)節(jié)炎對照組的結(jié)果相類似；而200μg/kg治療組和MTX治療組關(guān)節(jié)軟骨及其下的骨小梁結(jié)構(gòu)與正常組接近，但關(guān)節(jié)滑膜亦有一定程度的增生。由此表明在所選擇的20μg/kg、200μg/kg、400μg／kg 3種基因疫苗治療劑量中，200μg/kg劑量組對CIA大鼠后足踝關(guān)節(jié)的炎癥以及軟骨和骨的破壞的抑制作用最為明顯，可使炎癥分?jǐn)?shù)下降為對照組的50％(*P＜0.05)。對CIA大鼠后足踝關(guān)節(jié)X光放射學(xué)表現(xiàn)及評分結(jié)果進(jìn)一步分析表明：在關(guān)節(jié)炎對照組可見軟組織腫脹，骨關(guān)節(jié)邊緣模糊，軟骨破壞；而在所選擇的三種治療劑量組中，只有200μ／kg治療組治療效果最明顯(*P＜0.05)，可使軟組織腫脹減輕，關(guān)節(jié)間隙清晰，MTX治療組效果與200μg／kg治療組治療效果接近：而20μg／kg和400μg／kg治療組的關(guān)節(jié)軟骨表面和骨密度與關(guān)節(jié)炎組比較變化不明顯；此外，20μg／kg治療組的放射學(xué)分?jǐn)?shù)與空載體組類似，而400μg/kg治療組的放射學(xué)分?jǐn)?shù)卻稍有升高。特別應(yīng)該指出的是，200μg／kg基因疫苗組象MTX治療組一樣能顯著降低CIA大鼠血清中的抗CII抗體水平(P＜0.05)，而20μg／kg基因疫苗組與空載體組相比變化不大(P＞0.05)，但400μg／kg基因疫苗組卻顯著升高(P＜0.05)。因?yàn)闃I(yè)已證實(shí)，抗CII抗體水平反映了RA早期階段炎癥和骨質(zhì)破壞的程度，被認(rèn)為是揭示關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度最可靠的指標(biāo)。由此證明了pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗對CIA大鼠關(guān)節(jié)炎有顯著的治療作用，在缺乏外源脯氨酸羥化酶P4Hα、β的情況下并未影響pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗的體內(nèi)治療效應(yīng)。 為了探索pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗有效治療CIA大鼠的相關(guān)機(jī)制，我們較為系統(tǒng)的觀察了CIA大鼠注射pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗后4周脾細(xì)胞培養(yǎng)液中Th1和Th2因子如TGF-β1、TNF-α、IL-10、IL-4濃度的變化，CIA大鼠脾淋巴細(xì)胞特異性和非特異性增殖能力，CIA大鼠外周血中Th1／Th2細(xì)胞比例，CIA大鼠外周血中CD4~+CD25~+ Treg細(xì)胞占PBMC的比例以及大鼠外周血DC占PBMC的比例等指標(biāo)。結(jié)果表明：200μg／kg基因疫苗組的TGF-β和IL-10水平明顯增高(P＜0.05)，TNF-α濃度顯著降低(P＜0.05)，而IL-4的濃度水平各組之間無明顯變化(P＞0.05)；20μg／kg和400μg／kg基因疫苗組以及空載體組間則無顯著變化(P＞0.05)。脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示：200μg／kg基因疫苗組和MTX治療組的特異性脾淋巴細(xì)胞增殖能力明顯下降，與空載體組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，400μg／kg基因疫苗組的脾淋巴細(xì)胞增殖能力較空載體組卻有升高現(xiàn)象，其余3組差別不明顯(P＞0.05)；當(dāng)加入PHA進(jìn)行非特異性刺激后，各治療組的淋巴細(xì)胞都發(fā)生非特異性增殖，各組之間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在檢測CIA大鼠外周血中Th1／Th2比例時發(fā)現(xiàn)，Th1:Th2的比率在正常組平均為0.06(范圍是0.03-0.09)，200μg／kg治療組為0.08(范圍是0.06-0.11)，MTX治療組為0.08(范圍是0.05-0.16)，它們都顯著比空載體對照組低(P＜0.05)，表明了一個顯著的Th1→Th2細(xì)胞的“shift”；而此比率在20μg／kg與400μg／kg治療組以及空載體對照組之間沒有明顯區(qū)別(P＞0.05)。鑒于CD4~+CD25~+Treg在參與免疫調(diào)控尤其是自身免疫反應(yīng)的重要作用，我們還比較了正常組與各治療組以及空載體對照組中CD4~+淋巴細(xì)胞中CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞所占的比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：200μg／kg DcDNA3.1-CCOL2A1和MTX治療組中CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞比例明顯高于對照組(P＜0.05)；20μg／kg pcDNA3.1-CCOL2A1治療組中的CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞比例和對照組比幾乎沒有變化；而400μg／kg pcDNA3.1-CCOL2A1治療組CD4~+CD25~+Treg細(xì)胞比例雖然比對照組高，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。除此之外，我們又觀察了基因疫苗治療后CIA大鼠外周血DC占PBMC的比例，結(jié)果顯示，正常組中OX-62陽性細(xì)胞(DC)占外周血單個核細(xì)胞的比例為0.93±0.35％，CIA大鼠經(jīng)pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗治療4周后而各個治療組中的OX-62陽性細(xì)胞占外周血單個核細(xì)胞的比例分別為1.48±0.70％，1.02±0.61％，1.18±0.31％，1.07±0.25％and 1.04±0.33％，200μg／kg pcDNA3.1-CCOL2A1治療組與其它治療組、正常組及對照組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各個治療組與正常組及對照組之間的差異都沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。盡管目前我們還沒完全清晰pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗有效治療CIA大鼠的確切機(jī)制，但我們的上述結(jié)果高度提示，pcDNA3.1-CCOL2A1基因疫苗可能通過增加機(jī)體內(nèi)CD4~+CD25~+Treg，以降低T細(xì)胞對CII的特異性增殖反應(yīng)，由此誘導(dǎo)了Th1→Th2細(xì)胞的“shift”，從而有效下調(diào)Th1-因子并上調(diào)了Th2因子。 總之，本研究在國際上原創(chuàng)性地研制成功了能有效治療RA大鼠模型的新型Tolerizing性基因治療性疫苗pcDNA3.1-CCOL2A1，并較系統(tǒng)深入地探索了其治療的相關(guān)機(jī)理，該系列研究結(jié)果已申報(bào)了中國發(fā)明專利，受理號為200610111396.2。為今后進(jìn)一步利用DNATolerizing治療性疫苗策略治療RA奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。從理論上講，這既能增強(qiáng)治療的特異性，又能克服一般免疫抑制劑以及非類固醇類抗炎藥或DMARDs的嚴(yán)重毒副作用，還不會導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392;R593.22

【參考文獻(xiàn)】

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3 過邦輔;類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎外科學(xué)的概況[J];中華骨科雜志;1998年02期

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本文編號：1862577