本文選題：C5a + C5L2　； 參考：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 過敏毒素C5a是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)和趨化因子,在急性肺損傷、膿毒血癥、腦膜炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。C5a在體內(nèi)被羧肽酶作用后,其C-端第74位精氨酸(Arg)迅速地分離,而成為去精C5a(C5a des-Arg~(74))。C5a通過其受體-CD88和C5L2(C5a like receptor-2)來實(shí)現(xiàn)生物學(xué)活性。C5a與CD88通過兩點(diǎn)模型相互作用后,介導(dǎo)一系列的炎癥反應(yīng),如激發(fā)細(xì)胞脫顆粒,釋放組胺,增強(qiáng)血管通透性;誘導(dǎo)白細(xì)胞表達(dá)分泌IL-6等細(xì)胞因子。C5L2是C5a的新型受體,其最大的特點(diǎn)是與C5a/C5a des-Arg~(74)呈高親和力結(jié)合,且不與G蛋白偶聯(lián)、無信號(hào)傳導(dǎo)的清道夫受體,它可能通過有效地結(jié)合過敏毒素(如:C5a/C3a/C4a等)在清除和降低炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮主要作用。目前C5a-C5L2相互作用的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合模型尚未揭曉,僅根據(jù)CD88的研究推測其也為兩點(diǎn)結(jié)合模型,且C5L2 N端為主要的功能域,負(fù)責(zé)和絕大部分的配體結(jié)合。尋找C5L2蛋白和C5a的結(jié)合位點(diǎn),可以全面了解其功能,同時(shí)通過作用于該位點(diǎn)激活或促進(jìn)配受體的結(jié)合,理論上能夠阻斷或減少C5a-CD88的相互作用,從而降低C5a引起的炎癥反應(yīng),為治療炎性相關(guān)疾病找到一條新的通路。 體外定點(diǎn)突變技術(shù)可以對(duì)某個(gè)區(qū)域內(nèi)的特定堿基進(jìn)行定點(diǎn)改變、缺失或插入,通過突變前后蛋白質(zhì)功能的變化來研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。本研究就是通過生物信息學(xué)分析C5L2與C5a的可疑結(jié)合位點(diǎn),同源模建的方法預(yù)測C5L2三維立體結(jié)構(gòu);選取C5L2N端為研究對(duì)象,構(gòu)建多個(gè)突變體,通過原核表達(dá)野生型和突變型蛋白,利用生物傳感器檢測突變前后C5L2 N端蛋白與C5a結(jié)合力的變化,從而初步定位與C5a發(fā)生相互作用的關(guān)鍵區(qū)域;再合成1條含有該位點(diǎn)的多肽,通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證該多肽拮抗炎癥的效應(yīng),為進(jìn)一步研究C5L2的功能以及治療C5a相關(guān)疾病的研究奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法 1.利用生物信息學(xué)技術(shù)分析C5L2結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其分子的跨膜結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、可及性、柔韌性等;再通過同源模建的方法預(yù)測C5L2蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)。 2.利用基因重組技術(shù)和定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)野生型和突變型C5L2-N端重組體;經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),親和層析法純化融合蛋白,最后經(jīng)凝血酶Xa酶切純化后,獲得純度較高的目的蛋白。 3.rhC5a包被于生物傳感器芯片,分別檢測原核表達(dá)的野生型和突變型蛋白與rhC5a的結(jié)合力。 4.合成1條含有結(jié)合位點(diǎn)的多肽,命名為D3,在體外預(yù)先與rhC5a孵育30min后,加入中性粒細(xì)胞培養(yǎng)體系,培養(yǎng)4小時(shí)后,其細(xì)胞上清液經(jīng)ELISA檢測IL-6水平;復(fù)制小鼠內(nèi)毒素休克模型,通過對(duì)小鼠48h生存率的觀察,初步研究該多肽在體內(nèi)拮抗C5a的活性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.C5L2第3-22位、第179-183、第190-195位,第265-275位為其可能的配體結(jié)合域,由于C5L2 N-端,尤其是以ASP~(12,15,18)為中心的肽段呈現(xiàn)出高的親水性、柔韌性及可及性,使其成為本次研究的對(duì)象。同源模建獲得了C5L2蛋白的三維空間結(jié)構(gòu);表面靜電勢能圖顯示:C5a表面氨基酸殘基富集正電荷,C5L2表面富集負(fù)電荷,二者可以通過正負(fù)電荷的吸引完成配受體的結(jié)合。在此基礎(chǔ)上,以ASP為靶點(diǎn),確定了5個(gè)突變位點(diǎn),為進(jìn)行下一步的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 2.野生型表達(dá)載體經(jīng)PCR和酶切方法初步鑒定構(gòu)建成功,測序結(jié)果顯示目的片段插入正確,并命名為W;突變型表達(dá)載體測序結(jié)果顯示突變位點(diǎn)為設(shè)計(jì)位點(diǎn),我們將突變成功的2個(gè)缺失突變體命名為D-1和D-2,3個(gè)點(diǎn)突變體分別命名為S-1,S-2和S-3。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功后,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),獲得了分子量約33 kDa的野生型及突變型融合蛋白;親和層析技術(shù)獲得純度80%的融合蛋白;凝血酶Xa酶切純化后,得到了約為4 kDa的目的蛋白。 3.rhC5a成功包被于生物傳感器芯片。R4、W與S-1、S-2均可與rhC5a結(jié)合,結(jié)合率分別為88%,86%,85%和81%,四組問無顯著性差異(P＞0.05);S-3也可與rhC5a結(jié)合,但結(jié)合率明顯下降,為21%,與前四組蛋白結(jié)合率有顯著性差異(P＜0.01);而D-1、D-2則不與rhC5a發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng),從而初步尋找到了與rhC5a結(jié)合位點(diǎn)密切相關(guān)的區(qū)域和關(guān)鍵的氨基酸殘基。 4.多肽D3能顯著減少rhC5a刺激后中性粒細(xì)胞產(chǎn)生IL-6(P＜0.01);D3對(duì)LPS所致內(nèi)毒素休克小鼠具有明顯的保護(hù)作用,使D3治療組的生存率較對(duì)照組明顯提高(P＜0.01)。 結(jié)論 1.與CD88不同,C5L2 N-端ASP~(22,25,32)不是C5L2與C5a結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸。 2.C5L2 N-端第10-21位氨基酸(NH2-YGDYSDLSDRPV-COOH)可能是C5L2與C5a結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域,其中ASP~(12,15,18)起關(guān)鍵作用。 3.得到了一條具有抗炎效應(yīng)的多肽。
[Abstract]:C5a and CD88 interact with C5a / C5a des - Arg ~ ( 74 ) .


In vitro site - directed mutagenesis technique can be used to study the relationship between the structure and function of C5L2 in a certain region by site - directed mutagenesis , deletion or insertion . The study is to study the relationship between the structure and function of C5L2 by bioinformatics analysis .


experimental method


1 . The structure of C5L2 was analyzed by bioinformatics . The structure , secondary structure , hydrophilicity , accessibility , flexibility and so on were analyzed . The three - dimensional structure of C5L2 protein was predicted by homologous modeling .


2.Construction of prokaryotic expression wild - type and mutant C5L2 - N - terminal recombinant by using gene recombination technology and fixed - point mutation technology ; IPTG - induced expression and affinity chromatography to purify the fusion protein ; and finally , the target protein with higher purity is obtained after being cut and purified by thrombin Xa .


3 . rhC5a was coated on biosensor chip to detect the binding force of wild type and mutant protein expressed in prokaryotic expression and rhC5a respectively .


4 . A polypeptide containing binding site was synthesized and named D3 . After incubation with rhC5a in vitro for 30 min , neutrophil culture system was added . After 4 hours of culture , the supernatant of cells was detected by ELISA for IL - 6 levels . The mouse endotoxin shock model was replicated , and the activity of C5a in vivo was preliminarily studied by observing the 48h survival rate of mice .


experimental results


1 . C5L2 3 - 22 , 179 - 183 , 190 - 195 , 265 - 275 are their possible ligand binding domains . Since C5L2 N - terminal , especially the peptide segment centered on ASP ~ ( 12 , 15 , 18 ) exhibits high hydrophilicity , flexibility and accessibility , it becomes the object of this study .


2 . The wild type expression vector was constructed successfully by PCR and enzyme digestion method . The results showed that the target fragment was inserted correctly and named W . The mutant expression vector sequencing results showed that the mutation site was the design site . The two deletion mutants were named as D - 1 , S - 2 and S - 3 respectively . After the transformation of the recombinant plasmid , the fusion protein with molecular weight of about 33 kDa was obtained . The fusion protein with purity of 80 % was obtained by affinity chromatography .


3 . rhC5a was successfully coated on biosensor chip . The combination of R4 , W and S - 1 and S - 2 could be combined with rhC5a , the binding rate was 88 % , 86 % , 85 % and 81 % , respectively , but the binding rate was significantly decreased ( P < 0.01 ) .


4 . The IL - 6 ( P & lt ; 0.01 ) was significantly reduced by the polypeptide D3 after the stimulation of rhC5a , and D3 had obvious protective effect on LPS - induced endotoxic shock mice , and the survival rate of D3 treated group was significantly increased compared with the control group ( P < 0.01 ) .


Conclusion


1 . Unlike CD88 , C5L2 N - terminal ASP ~ ( 22 , 25 , 32 ) is not a key amino acid binding to C5L2 and C5a .


2.C5L2 N - terminal 10th - 21st amino acid ( NH2 - YGDYSDLSDRPV - COOH ) may be a key area of C5L2 binding to C5a , where ASP ~ ( 12 , 15 , 18 ) plays a key role .


3 . A polypeptide with anti - inflammatory effect is obtained .

【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1855154