本文選題：極化 + 激活　； 參考：《華中科技大學(xué)》2006年博士論文

【摘要】： 目的 研究超極化激活環(huán)核苷酸門控( hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated,HCN)陽離子通道對穿通纖維通路(perforant pathway,PP)——海馬CA3區(qū)突觸傳遞的影響及氨基酸釋放的調(diào)節(jié)作用,并探討二者之間的內(nèi)在聯(lián)系。 方法 應(yīng)用細(xì)胞外電生理記錄技術(shù)記錄電刺激PP誘發(fā)的CA3區(qū)群鋒電位(population spike,PS);高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)熒光檢測技術(shù)測定海馬組織及培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞外液中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸及γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)含量;透射電子顯微鏡技術(shù)觀察大鼠海馬組織CA3區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)的改變;建立新生大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)技術(shù),應(yīng)用熒光鈣成像系統(tǒng)觀察單個海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣的變化。 結(jié)果 第一部分HCN通道對PP—海馬CA3區(qū)突觸通路正常低頻突觸傳遞及海馬組織氨基酸釋放的影響 HCN通道阻滯劑ZD7288及CsCl對低頻刺激PP(0.5Hz)后90 min內(nèi)海馬CA3區(qū)PS幅值的的影響及海馬組織氨基酸含量的變化。生理鹽水對照組(Control組,施與低頻刺激,微注射生理鹽水1μL), ZD7288 (20,100,200 nmol)組(施與低頻刺激,注藥容積為1μL)及CsCl(1,5,10μmol)組(施與低頻刺激,注藥容積為1μL);各組大鼠于電生理記錄完畢迅速處死、取材、凍存?zhèn)錅y氨基酸含量。結(jié)果如下: ①特異性HCN通道阻滯劑ZD7288 20、100及200 nmol可劑量依賴降低CA3區(qū)PS幅值。90 min內(nèi)PS幅值分別為基礎(chǔ)值的69.72±1.79 %、45.23±1.5 %、28.07±4.65 %,較給藥前平均下降約30.28 %, 54.77%和71.94 %(P 0.01) ,并顯著低于生理鹽水對照組(P 0.01),給藥后5 min即起效,作用維持90 min以上。 ②非特異性HCN通道阻滯劑CsCl 1和10μmol,亦可顯著降低CA3區(qū)PS幅值。給藥90 min內(nèi)PS幅值分別為基礎(chǔ)值的78.61±2.06 %、44.79±2.11%,較給藥前平均下降了約21.38 %和55.2 %(P 0.01)。微量注射5μmol CsCl,在開始30 min,PS幅值為基礎(chǔ)值的58.4±1.37 %,下降顯著(P 0.01),此抑制效應(yīng)隨時間的延長而逐漸減弱,至90 min時,基本上與1μmol CsCl作用接近(P 0.05)。 ③HPLC測定氨基酸含量結(jié)果如下:正常組大鼠(未施與任何處理因素)谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和GABA含量依次為:129.6±31.7, 117.3±22.6, 123.9±34.9和225.3±42.4μmol/g.protein;生理鹽水對照組大鼠實(shí)驗(yàn)側(cè)海馬組織氨基酸含量依次為138.3±34.3 , 101.7±15.1, 113.3±40.5和227.4±41.9μmol/g.protein,與正常組比較無顯著差異(P 0.05)。ZD7288 100 nmol組上述四種氨基酸含量依次為:83. 5±15.6, 63.8±11.2, 73.1±28.2和124.7±23.6μmol/g.protein,均顯著低于生理鹽水對照組(all P 0.01, except for glycine P 0.05) ;CsCl 5μmol組大鼠則依次為75.9±10.3, 66.6±10.7, 80.4±15.2和157.4±26.2μmol/g.protein,亦顯著低于對照組(all P 0.01,except for glycine P 0.05)。 第二部分HCN通道對PP—CA3區(qū)突觸通路長時程增強(qiáng)(LTP)的影響 觀察ZD7288及CsCl于強(qiáng)直刺激(tetanus stimulation, TS;刺激電壓45 V,波寬0.15 ms,頻率500 Hz, 4串,每串含50脈沖,串間隔2s)前及后給藥對PP—CA3通路LTP PS幅值、起始潛伏期、峰潛伏期的變化,海馬CA3區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)的變化及海馬組織氨基酸含量變化。實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為:對照組即control組(僅給予測試刺激不施加強(qiáng)直刺激)、LTP誘導(dǎo)組即TS處理組(給予強(qiáng)直刺激誘導(dǎo)LTP后持續(xù)觀察90 min)、ZD7288—TS組(強(qiáng)直刺激前5 min于海馬CA3區(qū)局部注入ZD7288 100 nmol)、CsCl—TS組(強(qiáng)直刺激前5 min于海馬CA3區(qū)局部注入CsCl 5μmol)、TS—ZD7288組(強(qiáng)直刺激后30 min局部注入ZD7288 100 nmol)及TS—CsCl組(強(qiáng)直刺激后30 min局部注入CsCl 5μmol)。結(jié)果如下: ①強(qiáng)直刺激PP可誘導(dǎo)CA3區(qū)LTP形成,其后90 min內(nèi)PS幅值持續(xù)升高并穩(wěn)定在基礎(chǔ)幅值的281.8±6.6 %水平,顯著高于對照組(97.4±1.8 %)(P 0.01);強(qiáng)直刺激前給予ZD7288、CsCl,LTP的誘導(dǎo)明顯被抑制,90 min內(nèi)PS相對幅值均數(shù)分別為89.5±9.4%、62.9±18.0 %,顯著低于LTP組(P 0.01)而與對照組無顯著差異(P 0.05);但CsCl在30 min后抑制LTP PS幅度增加作用呈減弱趨勢。 ②強(qiáng)直刺激PP誘導(dǎo)LTP形成30 min后,給予ZD7288、CsCl, LTP效應(yīng)被翻轉(zhuǎn)。5 min時PS幅值即明顯下降,給藥后1h內(nèi)相對PS幅值均值分別為95.8±6.4 %、64.2±17.7 %均顯著低于LTP組(P 0.01),前者與對照組接近(P 0.05)而后者顯著低于對照組(P 0.01);隨時間延長,CsCl抑制作用逐漸減弱。 ③LTP誘導(dǎo)組大鼠PS起始潛伏期基礎(chǔ)值為5.154±0.350 ms,強(qiáng)直刺激后5 min PS起始潛伏期即顯著縮短(4.368±0.254 ms,P 0.01),90 min內(nèi)起始潛伏期均值為4.386±0.029 ms,較強(qiáng)直刺激前平均縮短約0.768 ms;且各記錄時間點(diǎn)PS起始潛伏期值均顯著小于對照組(all P 0.01)。強(qiáng)直刺激前分別給予ZD7288 100 nmol、CsCl 5μmol, PS起始潛伏期縮短幅度較LTP誘導(dǎo)組小,90 min內(nèi)較強(qiáng)直刺激前基礎(chǔ)值平均縮短約0.332 ms、0.267 ms,各時間點(diǎn)PS起始潛伏期值大于LTP誘導(dǎo)組(P 0.05);而CsCl以20～60 min內(nèi)作用最為顯著。TS—ZD7288組大鼠施與強(qiáng)直刺激后,30 min內(nèi)PS起始潛伏期較強(qiáng)直刺激前平均縮短約為0.725 ms(P 0.01);30 min時給予ZD7288 100 nmol,強(qiáng)直刺激導(dǎo)致的PS起始潛伏期的縮短效應(yīng)迅速被抑制,PS起始潛伏期延長達(dá)強(qiáng)直刺激前基礎(chǔ)值水平而顯著大于給藥前值(P 0.01),給藥后5 min即有明顯效應(yīng)(P 0.01),并可持續(xù)穩(wěn)定60 min;60 min內(nèi)各時間點(diǎn)PS起始潛伏期值均顯著大于LTP誘導(dǎo)組(all P 0.05)而與對照組接近(P 0.05)。強(qiáng)直刺激后30 min給予CsCl 5μmol可產(chǎn)生與ZD7288類似的效應(yīng)。 ④LTP誘導(dǎo)組大鼠PS峰潛伏期基礎(chǔ)值為7.833±0.585 ms,強(qiáng)直刺激后5 min PS起始潛伏期即顯著縮短(6.767±0.578 ms,P 0.01),90 min內(nèi)峰潛伏期均值為6.832±0.107 ms,較強(qiáng)直刺激前平均縮短約1.001 ms;各記錄時間點(diǎn)PS峰潛伏期值均顯著低于對照組( P 0.05)。強(qiáng)直刺激前給予ZD7288 100 nmol,90 min內(nèi)PS峰潛伏期平均值較強(qiáng)直刺激前基礎(chǔ)值縮短約0.579 ms,縮短幅度小于LTP誘導(dǎo)組(P 0.05);強(qiáng)直刺激前給予CsCl 5μmol,30 min內(nèi)PS峰潛伏期仍顯著縮短,與LTP誘導(dǎo)組比無差異(P 0.05),30 min后PS峰潛伏期逐漸延長與強(qiáng)直刺激前基礎(chǔ)值水平接近甚至更長,與對照組比較無顯著性差異(P 0.05)。TS—ZD7288組大鼠施加強(qiáng)直刺激后,PS峰潛伏期較強(qiáng)直刺激前(7.291±1.602 ms)顯著減小(P 0.01),并持續(xù)穩(wěn)定在6.415±0.006 ms,30 min內(nèi)平均縮短約為0.876 ms;30 min時給予ZD7288 100 nmol,強(qiáng)直刺激所致的PS峰潛伏期縮短作用迅速被抑制,PS峰潛伏期延長達(dá)強(qiáng)直刺激前基礎(chǔ)值水平而顯著大于給藥前值(P 0.01),給藥后5 min即產(chǎn)生明顯效應(yīng)(P 0.01),該效應(yīng)于給藥后60 min內(nèi)可持續(xù)穩(wěn)定維持;強(qiáng)直刺激后30 min給予CsCl 5μmol可產(chǎn)生與ZD7288類似的效應(yīng)。 ⑤HPLC測定氨基酸含量結(jié)果如下:對照組(Control)、LTP誘導(dǎo)組、ZD7288—TS組、CsCl—TS組、TS—ZD7288組及TS—CsCl組大鼠海馬組織中谷氨酸含量依次為:138.3±34.3、153.7±35.2、112.6±35.6、99.5±36.6、106.6±30.0及132.7±51.9μmol/g.protein,LTP誘導(dǎo)組谷氨酸水平較對照組呈增加趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;ZD7288—TS組、TS—ZD7288組及CsCl—TS組谷氨酸含量顯著低于LTP誘導(dǎo)組(P 0.05);以上各組天冬氨酸含量依次為:96.7±21.0、95.2±31.2、87.3±27.0、70.0±23.0、69.4±15.6及89.2±29.0μmol/g.protein,各組之間天冬氨酸含量無顯著差異(P 0.05);以上各組甘氨酸含量依次為:113.4±40.5、60.1±17.4、105.6±44.5、62.7±19.8、91.8±39.6及88.1±31.7μmol/g.protein,LTP誘導(dǎo)組甘氨酸含量顯著低于對照組(P 0.01),而ZD7288—TS組甘氨酸含量較LTP誘導(dǎo)組增加(P 0.05)而與對照組接近(P 0.05);各組GABA含量依次為:206.4±65.4、119.3±30.6、189.6±48.1、176.3±40.0、171.7±10.9及200.6±26.7μmol/g.protein , LTP誘導(dǎo)組GABA含量顯著低于對照組(P 0.01), ZD7288—TS組、CsCl—TS組、TS—ZD7288組及TS—CsCl組GABA含量較LTP誘導(dǎo)組顯著增加(P 0.05 or P 0.01)。 ⑥對照組大鼠海馬CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)以突觸連接面為平直型的突觸較為多見,也可見少數(shù)凸面突觸,突觸前膜和突觸后膜清晰,突觸間隙清楚,突觸前終末端聚集較多圓形的突觸囊泡,突觸前膜胞漿面附有少數(shù)錐形霧樣致密物質(zhì)即突觸前致密突起(presynaptic dense projection),突觸后膜胞漿面有一層濃密的電子致密物質(zhì)附著即突觸后致密物(postsynaptic membrance density, PSD)。LTP誘導(dǎo)組可見平直型突觸數(shù)目明顯增加,同一神經(jīng)元軸突可與其他同一神經(jīng)元或多個神經(jīng)元形成多個突觸聯(lián)系即突觸小球形成,突觸前胞漿內(nèi)可見突觸囊泡聚集,顯示囊泡的軸漿運(yùn)輸活躍;突觸后致密物較對照組顯著增厚,突觸間歇變模糊,似有霧狀物存在;凸面突觸多見,突觸前終末端可見大量圓形囊泡聚集成葡萄串狀,突觸間歇變模糊,突觸后致密物亦明顯增厚。與LTP誘導(dǎo)組比較,透射電鏡視野下ZD7288—TS組大鼠海馬CA3區(qū)突觸數(shù)目減少,可發(fā)現(xiàn)較少的平直型突觸及凸面突觸,未發(fā)現(xiàn)突觸小球,突觸后致密物變薄,突觸前囊泡數(shù)目減少,軸漿運(yùn)輸受抑制,突觸間歇變清晰;CsCl—TS組突觸結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)與ZD7288—TS組類似變化。 第三部分HCN通道對培養(yǎng)海馬神經(jīng)元氨基酸釋放及谷氨酸引起的鈣內(nèi)流的影響 在細(xì)胞水平,研究HCN通道對體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元氨基酸釋放以及谷氨酸所致鈣內(nèi)流的影響。結(jié)果如下: ①正常細(xì)胞對照組、cAMP 5μM、50μM組、ZD7288 5μM及50μM組細(xì)胞外液谷氨酸含量依次為99.2+17.7、136.1±25.7、188.1±47.7、31.4±7.1及4.4±1.0μmol/L,天冬氨酸含量依次為0.181±0.0517、0.190±0.0884、0.214±0.1243、0.203±0.0905及0.288±0.0747μmol/L,甘氨酸含量依次為13.01±4.32、265.1±37.1、397.8±50.7、3.20±1.56及1.65±0.94μmol/L,GABA含量依次為3.256±0.2925、3.061±0.322,3.227±0.422,0.852±0.297及0.297±0.052μmol/L,顯示cAMP可顯著增加海馬神經(jīng)元細(xì)胞外液中谷氨酸及甘氨酸含量并隨劑量增大,作用增強(qiáng)(P 0.01);對天冬氨酸及GABA含量則無顯著影響。ZD7288可使谷氨酸及GABA水平下降并呈現(xiàn)量效關(guān)系(P 0.01);同時降低細(xì)胞外液中甘氨酸水平(P 0.01),對天冬氨酸含量無顯著影響。 ②海馬神經(jīng)元置于標(biāo)準(zhǔn)外液中,向細(xì)胞灌流槽內(nèi)加入谷氨酸50μM時,數(shù)秒內(nèi)可引起F340/380熒光比值顯著增加,并迅速出現(xiàn)尖銳高聳的鈣峰,此后較長時間維持在一穩(wěn)態(tài)高鈣水平,給藥后鈣增加率為78.01±10.32%;換為無鈣外液時,比值則無明顯影響。表明谷氨酸引起培養(yǎng)海馬神經(jīng)元[Ca2+]i上升過程中,細(xì)胞外Ca2+的大量內(nèi)流起著主導(dǎo)作用。 ③海馬神經(jīng)元置于標(biāo)準(zhǔn)外液中,熒光值穩(wěn)定后,分別加入終濃度為25μM、50μM、100μM ZD7288,孵育20 min后熒光值無明顯變化; ZD7288分別25μM、50μM、100μM孵育20 min后再加入谷氨酸50μM(終濃度);發(fā)現(xiàn)F340/380熒光比值增加較谷氨酸50μM處理組顯著降低,鈣峰出現(xiàn)緩慢而低平;對應(yīng)的鈣熒光增加率分別為59.22±8.72%,41.35±7.25%,21.01±4.41%,各組之間有顯著差異(P 0.01),表明ZD7288可劑量依賴性抑制谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣增加。 ④海馬神經(jīng)元置于標(biāo)準(zhǔn)外液中,熒光值穩(wěn)定后,分別加入終濃度為5μM,50μM cAMP孵育5 min后再加入谷氨酸50μM(終濃度),F340/380熒光比值迅速增加且高于谷氨酸50μM處理組(P 0.01),并在較長時間內(nèi)維持在較高的水平;對應(yīng)的鈣熒光增加率分別為101.33±9.89,125.36±11.04%(P 0.01);50μM ZD7288孵育20 min后,加入50μM cAMP, F340/380熒光比值增加幅度、鈣峰出現(xiàn)的時間和形狀與僅加入谷氨酸50μM時相近,鈣熒光增加率為86.23±10.53%,與谷氨酸50μM處理組無顯著差異(P 0.05),表明HCN通道對谷氨酸誘導(dǎo)鈣內(nèi)流具有調(diào)節(jié)作用。 結(jié)論 1 HCN通道參與PP—海馬CA3區(qū)通路正常低頻突觸傳遞過程,其機(jī)制可能與其對氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)有關(guān)。 2 HCN通道參與PP—海馬CA3區(qū)突觸通路LTP的誘導(dǎo)和形成,其機(jī)制可能為: ①促進(jìn)突觸前谷氨酸的釋放而抑制GABA及甘氨酸的釋放 ②促進(jìn)谷氨酸引起的突觸后細(xì)胞內(nèi)鈣的增加 ③調(diào)節(jié)突觸前、后超微結(jié)構(gòu)的改變。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R33

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 蔣春雷，徐獲，由振東，黃愛軍，，宋朝佑，王成海，劉新垣，路長林;白細(xì)胞介素－2中樞鎮(zhèn)痛作用途徑的探討[J];生理學(xué)報(bào);1996年03期

2 孫鐵,胡還忠,徐旭林,余上斌,歐陽昌漢,曲玲,呂青,郭蓮軍;谷氨酸及其受體拮抗劑對大鼠海馬CA3區(qū)誘發(fā)電位的影響[J];中國藥理學(xué)通報(bào);2004年04期

3 劉娜,左萍萍,周帆,張放,劉景生,任民峰;連二亞硫酸鈉致PC12和NG108-15細(xì)胞擬缺血損傷研究[J];中國藥理學(xué)通報(bào);1998年06期

4 徐有秋;I_f離子流和心臟起搏[J];中華心律失常學(xué)雜志;2001年04期

本文編號：1853651