本文選題：B7-H4 + 重組腺病毒�。� 參考：《浙江大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： T細(xì)胞的活化需要兩個(gè)信號(hào)：第一信號(hào)是由TCR-MHC—抗原肽復(fù)合物引起T細(xì)胞交聯(lián)并啟動(dòng)特異性抗原識(shí)別信號(hào)；T細(xì)胞活化的第二信號(hào)為共刺激信號(hào)，是由APC和T細(xì)胞表面多種粘附分子對(duì)組成。共刺激信號(hào)不僅能提供促進(jìn)T細(xì)胞活化、增殖和細(xì)胞因子分泌的正性共刺激信號(hào)，，而且能傳遞、削弱和終止T細(xì)胞活化增殖的負(fù)性共刺激信號(hào)，它們?cè)诿庖叻磻?yīng)的不同時(shí)相發(fā)揮各自的作用。B7-CD28分子家族是一類重要的調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的共刺激分子。B7-1和B7-2及其受體CD28／CTLA-4代表經(jīng)典的正性和負(fù)性共刺激信號(hào)途徑。 B7-H4是由Sica等2003年發(fā)現(xiàn)的B7家族新成員。B7-H4 mRNA廣泛地表達(dá)在外周組織：腎、肝、脾、肺、胸腺和胎盤等，但免疫組化分析正常的組織未見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。B7-H4在移植物抗宿主疾病(GVHD)等自身免疫性疾病組織及肺癌、卵巢癌、乳腺癌等細(xì)胞上均有高表達(dá)，說(shuō)明B7-H4分子的表達(dá)在翻譯水平上受到嚴(yán)格的調(diào)控；另外，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明B7-H4分子可以抑制包括Th1型和Th2型細(xì)胞因子的分泌，如：IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ等。阻斷B7-H4與其受體的相互作用，有望成為干預(yù)自身免疫性疾病和腫瘤生物治療的潛在靶點(diǎn)。因此，B7-H4分子途徑提供了對(duì)癌癥、自身免疫性疾病和抗病毒及移植排斥反應(yīng)等疾病新的治療思路。 為更深入研究B7-H4的作用機(jī)制及在免疫耐受方面的應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)利用AdEasy~(TM)XL系統(tǒng)構(gòu)建攜帶小鼠B7-H4基因(mB7-H4)的重組腺病毒，并進(jìn)行生物學(xué)活性鑒定。 方法：從小鼠肺組織中通過(guò)RT-PCR獲取約870bp大小的目的基因，測(cè)序正確后克隆至穿梭載體pShuttle-CMV構(gòu)建重組穿梭載體；PmeⅠ線性化重組穿梭載體質(zhì)粒后電轉(zhuǎn)化BJ5183-AD-1感受態(tài)細(xì)菌，以細(xì)菌內(nèi)同源重組方式完成腺病毒骨架與穿梭質(zhì)粒的同源重組，構(gòu)建攜帶mB7-H4的重組腺病毒的質(zhì)粒plasmid-mB7-H4／Ad；經(jīng)人胚胎腎細(xì)胞(AD-293)包裝后產(chǎn)生復(fù)制缺陷的重組腺病毒mB7-H4／Ad。提取感染重組腺病毒的AD-293細(xì)胞總RNA及總蛋白，以RT-PCR及Western Blot方法檢測(cè)B7-H4 mRNA和蛋白的表達(dá)。重組腺病毒擴(kuò)增三代后，用半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(Tissue culture infectious dose 50，TCID50)方法檢測(cè)腺病毒的滴度。最后，將重組腺病毒感染小鼠成纖維細(xì)胞(L929)，用感染了重組腺病毒的L929細(xì)胞進(jìn)行T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞因子分泌水平的檢測(cè)。 結(jié)果：重組腺病毒mB7-H4／Ad轉(zhuǎn)染AD-293細(xì)胞3天后可觀察到病變的出現(xiàn)，6～7天后，大部分細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、脫落等細(xì)胞致病變效應(yīng)(CPE)；RT-PCR檢測(cè)表明B7-H4在AD-293細(xì)胞可正確轉(zhuǎn)錄；Western Blot檢測(cè)顯示mB7-H4／Ad表達(dá)的蛋白可與小鼠B7-H4 IgG單克隆抗體特異性結(jié)合，而且分子量大小與預(yù)期一致；病毒擴(kuò)增三代后，病毒滴度達(dá)到2×10~8pfu／ml。感染了mB7-H4／Ad的L929細(xì)胞能夠有效抑制抗小鼠CD3誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的分泌水平，說(shuō)明mB7-H4／Ad所表達(dá)的B7-H4分子具有生物學(xué)活性。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功地構(gòu)建了表達(dá)B7-H4的重組腺病毒mB7-H4／Ad，所構(gòu)建的mB7-H4／Ad具有免疫抑制功能。
[Abstract]:Activation of T cells requires two signals : the first signal is caused by TCR - MHC - antigen peptide complexes which cause T cell cross - linking and initiate specific antigen recognition signals ;
B7 - CD28 molecule family is an important co - stimulatory molecule that regulates immune response . B7 - 1 and B7 - 2 and its receptor CD28 / T 4 - 4 represent classical positive and negative costimulatory signal pathways .









B7 - H4 mRNA was expressed in peripheral tissues : kidney , liver , spleen , lung , thymus and placenta .
In addition , in vivo experiments prove that B7 - H4 molecules can inhibit the secretion of Th1 - type and Th2 - type cytokines , such as IL - 2 , IL - 4 , IL - 10 , IFN - 緯 , etc . The interaction between B7 - H4 and its receptors is blocked , which is expected to be a potential target for the intervention of autoimmune diseases and tumor biological treatment .









In order to study the mechanism of B7 - H4 and its application in immune tolerance , the recombinant adenovirus carrying mouse B7 - H4 gene ( mB7 - H4 ) was constructed with AdEasy ~ ( TM ) XL system .









Methods : The recombinant shuttle vector pShuttle - CMV was cloned into shuttle vector pShuttle - CMV by RT - PCR in mouse lung tissue .
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本文編號(hào)：1852078