本文選題：天花粉蛋白 + 表皮生長因子��； 參考：《第一軍醫(yī)大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 背景 腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的一類疾病,尋找有效的抗腫瘤藥物與方法是世界醫(yī)學(xué)界的重要研究課題。研究表明許多中藥具有抗腫瘤作用,但其作用成分復(fù)雜,具有多種作用成分和通過多種作用途徑產(chǎn)生抗腫瘤作用。弄清中藥的抗腫瘤作用途徑和靶位點對加速抗腫瘤中藥的開發(fā)具有重要意義。近50年來盡管腫瘤治療取得了一些進展,化療、放療、手術(shù)仍是治療基本手段。但是由于現(xiàn)有的化療藥物和放療的選擇性不高,殺傷腫瘤細(xì)胞的同時也損害體內(nèi)正常細(xì)胞,治療中常出現(xiàn)較明顯的毒副反應(yīng),所以研究、開發(fā)一種對腫瘤細(xì)胞選擇性高、殺傷作用強但對正常組織副作用小的抗腫瘤藥物非常有意義。免疫毒素是提高治療效果的一條重要途徑,是新一代的癌癥治療方法,此療法與傳統(tǒng)的化療不同,其藥物能在腫瘤部位有相對較高的濃度,存留較長時間,對腫瘤靶細(xì)胞有較強的殺傷活性,而對正常細(xì)胞無作用或毒性很小,免疫毒素是靶向性治療腫瘤的有代表性的藥物,也是免疫學(xué)研究的熱點之一,被稱為“生物導(dǎo)彈”,近年來利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了不同用途的免疫毒素。免疫毒素是具有導(dǎo)向能力的分子(載體)和具有細(xì)胞毒性的分子(毒素)構(gòu)成的具有特異性細(xì)胞殺傷能力的雜合分子。載體一般由抗體、細(xì)胞因子和激素等組成,毒素一般為來自于細(xì)菌或植物。載體可以把毒素定向帶到病灶部位,將癌細(xì)胞或病變細(xì)胞殺死,而很少傷害正常細(xì)胞。研究表明,免疫毒素在體內(nèi)具有靶向性,使毒素更易于與腫瘤細(xì)胞結(jié)合,大大提高了毒素對腫瘤細(xì)胞的殺傷率,降低了其對正常細(xì)胞的毒副作用。 天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)是從葫蘆科植物栝蔞的根塊中提取出來的一種堿性蛋白,屬于Ⅰ型核糖體失活蛋白(ribosome inactivating proteins,RIPs)。天花粉蛋白臨床主要用于引產(chǎn)及宮外孕、葡萄胎、絨癌等的治療,另外使核糖體不可逆失活,從而抑制蛋白質(zhì)的合成,其應(yīng)用范圍已涉及抗病毒、抗腫瘤等方面,同時可抑制艾滋病病毒在感染的免疫失活細(xì)胞內(nèi)復(fù)制繁衍,此外還發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的細(xì)胞系統(tǒng)中,TCS對乙腦、乙肝、麻疹、單純皰疹及水泡性口腔炎等病毒均有明顯抑制作用,并且這種抑制作用與TCS的濃度呈正相關(guān)。但是由于天花粉蛋白在臨床上使用所產(chǎn)生的副作用,限制了它進一步的推廣和應(yīng)用,我們可以考慮如何在TCS不引發(fā)過敏反應(yīng)的劑量內(nèi),最大限度的發(fā)揮其抗腫瘤作用,這就需要我們找到一種能與TCS一起最大限度發(fā)揮協(xié)同殺傷腫瘤細(xì)胞的物質(zhì)。 表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的異常高表達可見于多種惡性腫瘤,并與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為以及腫瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。EGFR已成為陽性表達腫瘤的重要治療靶標(biāo)。以EGFR為靶點的治療主要有單克隆抗體以及小分子化合物激酶拮抗劑兩種方式,目前已進行了廣泛的實驗與臨床研究,其抗腫瘤的主要作用機制包括:細(xì)胞周期阻滯、促凋亡、抗腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移、抗新生血管生成、放化療細(xì)胞毒增敏等。此外,以人EGFR為免疫原在小鼠體內(nèi)可以激發(fā)特異的免疫反應(yīng),該反應(yīng)能交叉反應(yīng)于鼠同源EGFR,進而達到治療EGFR陽性表達腫瘤的目的。迄今,EGFR靶向治療均很少觀察到顯著的EGFR相關(guān)的毒副作用,這可能與正常細(xì)胞EGFR顯著的調(diào)控性低表達以及對EGFR通路信號的相對不依賴性相關(guān)。 為此,本研究以傳統(tǒng)中藥天花粉蛋白為毒素,人表皮生長因子為載體,利用基因工程技術(shù),制備重組免疫毒EGF-Linker-TCS,并對其靶向性抗腫瘤作用給予評價,為中醫(yī)藥在抗腫瘤方面的應(yīng)用進行了有益的探索,對促進中藥開發(fā)、中藥現(xiàn)代化具有一定的意義。 目的 1、因天花粉蛋白成分復(fù)雜,純化步驟繁瑣,得率低,目前構(gòu)建的攜帶有天花粉蛋白基因的表達載體其表達水平較低,并且費用昂貴,為后續(xù)的研究帶來困難。本實驗擬通過基因工程技術(shù),摸索出可以高效、穩(wěn)定、簡單、廉價的制備高純度融合蛋白TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS的方法。 2、對正常人肝LO-2細(xì)胞、肝癌BEL-7402細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞和胃腺癌BGC-823細(xì)胞表面EGF受體表達量進行檢測,探討EGF作為靶向抗腫瘤免疫毒素載體的可能性。 3、通過結(jié)晶紫法,計算TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS對正常人肝LO-2細(xì)胞、肝癌BEL-7402細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞和胃腺癌BGC-823細(xì)胞的半數(shù)抑制有效濃度(IC_(50))及其選擇指數(shù)、應(yīng)用流式細(xì)胞儀對TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究,對TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS的體外靶向抗腫瘤作用給予評價。 4、研究免疫毒素EGF-Linker-TCS對建立荷人肝癌BEL-7402細(xì)胞的裸鼠模型,研究腫瘤生長抑制及移植腫瘤的肝轉(zhuǎn)移情況,對EGF-Linker-TCS的體內(nèi)靶向抗腫瘤作用給予評價。 方法 1、克隆、表達、純化TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS融合蛋白 提取栝蔞基因組,使用PCR方法擴增TCS基因,將TCS基因插入到pQE30載體中,構(gòu)建TCS的原核表達質(zhì)粒pQE30/TCS;使用PCR方法擴增EGF基因,將EGF基因插pQE30/TCS中,構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pQE30/EGF-TCS;考慮到融合蛋白中間加Linker可能會使兩個蛋白更好的保持各自的構(gòu)象,更好的保持各自的生物學(xué)活性,使用PCR方法擴增了EGF-Linker基因,將EGF-Linker基因插入pQE30/TCS中,構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pQE30/EGF-Linker-TCS,分別進行基因測序。將這三個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至M15工程菌中誘導(dǎo)表達,SDS-PAGE重組蛋白在M15工程菌中的表達,檢測表達量占菌體蛋白總量。將鑒定的重組質(zhì)粒pQE30/TCS、pQE30/EGF-TCS、pQE30/EGF-Linker-TCS轉(zhuǎn)化至M15工程菌中,挑單菌落接種于含Amp50μg/ml LB培養(yǎng)基中,搖床培養(yǎng),至OD值為0.6時,分別加入IPTG誘導(dǎo)表達,取樣做SDS-PAGE分析。IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS 3h,超聲波破碎菌體,離心后取上清液,用Ni-NTA Agrose親和純化,檢測樣品的純度。 2、正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的EGF受體表達量的檢測 EGF和TCS構(gòu)成的融合蛋白靶向性抗腫瘤的靶點是EGF受體,使用流式細(xì)胞儀對正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞表面的EGF受體表達量進行檢測。 3、TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS對正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制有效濃度(IC_(50))及其選擇指數(shù)的確定 采用結(jié)晶紫法檢測純化的TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,測定其對細(xì)胞的半數(shù)抑制有效濃度(IC_(50))及其選擇指數(shù)。按以下公式計算殺傷率:殺傷率(%)=[(對照孔A值-實驗孔A值)/對照孔A值]×100%,通過計算細(xì)胞生長的抑制百分率,用origin 6.0軟件計算出IC_(50),并根據(jù)IC_(50)值計算出選擇指數(shù):選擇指數(shù)=IC_(50)(正常細(xì)胞)/IC_(50)(腫瘤細(xì)胞)。 4、流式細(xì)胞儀檢測EGF-TCS、EGF-Linker-TCS選擇性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況 EGF-TCS和EGF-Linker-TCS可以通過EGF受體結(jié)合腫瘤細(xì)胞,TCS可以使腫瘤細(xì)胞的核糖體失活,蛋白合成抑制而死亡。TCS除了核糖體失活,有可能還有其它機制導(dǎo)致真核細(xì)胞死亡,我們使用流式細(xì)胞儀觀察EGF-TCS、EGF-Linker-TCS誘導(dǎo)LO-2、BEL-7402、MCF-7和BGC-823細(xì)胞的凋亡作用。 5、電鏡觀察EGF-Linker-TCS對肝癌BEL-7402細(xì)胞凋亡的影響 使用電鏡觀察EGF-Linker-TCS對肝癌BEL-7402細(xì)胞的影響,進一步研究EGF-Linker-TCS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機制。 6、EGF-Linker-TCS對裸鼠的腫瘤模型的體內(nèi)抑瘤實驗 分別給裸鼠右腋皮下接種人肝癌BEL-7402細(xì)胞,接種后第6天,尾靜脈注射100μg/kg、50μg/kg和25μg/kg EGF-Linker-TCS進行治療,設(shè)空白對照組,停藥后第2天處死小鼠,稱量瘤重,計算抑瘤率,取出肝臟計算腫瘤轉(zhuǎn)移灶。腫瘤組織用10%甲醛固定做免疫組織化學(xué)實驗,從而研究其抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的途徑。 結(jié)果 1、TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS融合蛋白的制備 對pQE30/TCS、pQE30/EGF-TCS和pQE30/EGF-Linker-TCS三個質(zhì)粒分別進行基因測序,測序結(jié)果表明與設(shè)計一致;將這三個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至M15工程菌中,誘導(dǎo)表達,SDS-PAGE結(jié)果表明重組蛋白在M15工程菌中以可溶性形式表達,表達量均占菌體蛋白總量的30%。免疫印跡分析結(jié)果顯示,重組蛋白可與特異性抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。純化的樣品純度均超過95%。 2、正常肝細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的EGF受體檢測 使用流式細(xì)胞儀對正常肝細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的EGF受體進行了檢測,檢測結(jié)果顯示正常肝LO-2細(xì)胞EGF受體陽性表達量為5.51%,肝癌BEL-7402細(xì)胞EGF受體陽性表達量為72.33%,乳腺癌MCF-7細(xì)胞EGF受體陽性表達量為63.92%,胃腺癌BGC-823細(xì)胞EGF受體陽性表達量為70.41%。腫瘤細(xì)胞的EGF受體數(shù)量明顯高于正常細(xì)胞。 3、TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS對正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的半數(shù)抑制有效濃度(IC_(50))及其選擇指數(shù)結(jié)果 結(jié)果顯示:TCS對LO-2、BEL-7402、MCF-7和BGC-823細(xì)胞的IC_(50)分別為39.70μg/ml、33.37μg/ml、36.53μg/ml、41.52μg/ml,對BEL-7402、MCF-7和BGC-823細(xì)胞選擇指數(shù)分別為1.19、1.09、0.96;EGF-TCS對LO-2、BEL-7402、MCF-7和BGC-823細(xì)胞的IC_(50)分別為115.34μg/ml、8.90μg/ml、13.75μg/ml、15.36μg/ml,對BEL-7402、MCF-7和BGC-823細(xì)胞選擇指數(shù)分別為12.96、8.39、7.51;EGF-Linker-TCS對LO-2、BEL-7402、MCF-7和BGC-823細(xì)胞的IC_(50)分別為113.99μg/ml、6.98μg/ml、11.97μg/ml、13.53μg/ml,對BEL-7402、MCF-7和BGC-823細(xì)胞選擇指數(shù)分別為16.33、9.52、8.43。實驗的結(jié)果符合我們的設(shè)計,EGF-TCS和EGF-Linker-TCS對腫瘤細(xì)胞的IC_(50)要小于TCS,而對正常細(xì)胞的IC_(50)與TCS接近,EGF-TCS和EGF-Linker-TCS的選擇指數(shù)高于TCS,均大于2,符合靶向藥物的要求,EGF-Linker-TCS對腫瘤細(xì)胞的IC_(50)低于EGF-TCS,選擇指數(shù)高于EGF-TCS。 4、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示:EGF-TCS對乳腺癌MCF-7細(xì)胞、胃腺癌BGC-823、肝癌BEL-7402細(xì)胞的凋亡率分別為35.61%、39.59%、50.57%,同樣的劑量只能引起正常肝LO-2細(xì)胞少量的凋亡,凋亡率僅為8.99%,結(jié)果表明EGF-TCS(5μg/ml)具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生凋亡的作用;EGF-Linker-TCS(5μg/ml)也同樣具有誘腫瘤細(xì)胞乳腺癌MCF-7細(xì)胞、胃腺癌BGC-823細(xì)胞、肝癌BEL-7402細(xì)胞凋亡的作用,凋亡率分別為:36.67%、42.56%、58.56%,同樣的劑量只能引起正常肝LO-2細(xì)胞少量的凋亡,凋亡率僅為8.08%。 5、電鏡觀察EGF-Linker-TCS對BEL-7402細(xì)胞的影響 電鏡下可見對照組細(xì)胞核清晰完整,有豐富正常的線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng);EGF-Linker-TCS蛋白組出現(xiàn)細(xì)胞凋亡不同時期特征,染色質(zhì)濃集,核不規(guī)則,可見空泡狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng),凋亡小體。 6、EGF-Linker-TCS對荷人肝癌裸鼠腫瘤模型體內(nèi)的抑瘤實驗 為了進一步觀察重組毒素的抗腫瘤效果,我們使用EGF-Linker-TCS重組蛋白對裸鼠的腫瘤模型進行了體內(nèi)的抑瘤實驗,結(jié)果表明EGF-Linker-TCS能明顯的抑制裸鼠實體瘤的生長。高、中和低劑量組的抑制率分別為71.3%、60.87%和45.22%,對治療結(jié)束后各組平均瘤重進行統(tǒng)計學(xué)分析,說明EGF-Linker-TCS能明顯的抑制裸鼠實體瘤的生長,結(jié)果有顯著性差異(F=8.712P=0.006);同時我們也觀察了藥物對移植腫瘤肝轉(zhuǎn)移的抑制情況,解剖裸鼠檢查肝臟,可見移植瘤轉(zhuǎn)移到肝臟后呈現(xiàn)單個的白色病灶,對每只裸鼠的肝轉(zhuǎn)移病灶計數(shù)后進行統(tǒng)計學(xué)分析,結(jié)果表明EGF-Linker-TCS能顯著的抑制裸鼠移植瘤肝臟轉(zhuǎn)移,結(jié)果有顯著性差異(F=8.744 P=0.002);免疫組化結(jié)果顯示EGF-Linker-TCS可以明顯的抑制腫瘤血管的形成,高劑量組腫瘤組織未有可見血管,中低劑量組腫瘤組織血管明顯少于模型組,其抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的途徑可能是通過抑制腫瘤血管生長來抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移。 結(jié)論 經(jīng)上述研究,可以得出以下結(jié)論: 1、通過基因工程技術(shù),摸索出了可以高效、穩(wěn)定、簡單、廉價的制備高純度融合蛋白TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS的方法,為下一步研究其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。 2、在很多腫瘤細(xì)胞表面EGF受體過度表達,EGF可以特異地結(jié)合腫瘤細(xì)胞過度表達的EGF受體,可以用于免疫毒素的導(dǎo)向。 3、通過TCS、EGF-TCS、EGF-Linker-TCS對腫瘤細(xì)胞體外靶向殺傷作用的研究,證明EGF-TCS、EGF-Linker-TCS對腫瘤細(xì)胞具有良好的選擇性,選擇指數(shù)大于2,并且具有較高的細(xì)胞毒性,對正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性要小于TCS。 4、免疫毒素EGF-Linker-TCS能明顯抑制肝癌動物模型腫瘤生長及腫瘤的肝轉(zhuǎn)移,說明EGF-Linker-TCS對實體瘤作用明顯。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392;R730.5

【參考文獻】

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本文編號：1833272