本文選題：尖吻蝮蛇 + 蛇毒蛋白��； 參考：《中國(guó)生物制品學(xué)雜志》2014年01期

【摘要】：目的構(gòu)建人源尖吻蝮蛇毒蛋白抗體單鏈可變區(qū)片段(scFv)噬菌體文庫(kù)。方法采用Trizol試劑提取尖吻蝮蛇咬傷后恢復(fù)期患者的外周血淋巴細(xì)胞的總RNA,用Oligotex姈mRNA Mini Kits純化獲得總mRNA,逆轉(zhuǎn)錄合成總cDNA,針對(duì)人抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因設(shè)計(jì)一系列特異性引物,以合成的總cDNA為模板,擴(kuò)增得到抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因庫(kù),再通過(guò)重疊延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)將輕鏈和重鏈拼接得到scFv文庫(kù);將scFv基因雙酶切后,插入T7噬菌體骨架進(jìn)行包裝,以尖吻蝮蛇蛇毒蛋白抗原進(jìn)行4輪淘選,建立蛇毒蛋白抗體scFv噬菌體文庫(kù),采用噬斑法檢測(cè)scFv噬菌體文庫(kù)滴度并進(jìn)行PCR及測(cè)序鑒定。結(jié)果成功地將輕鏈和重鏈可變區(qū)基因庫(kù)混合拼接得到scFv文庫(kù);經(jīng)4輪淘選,蛇毒蛋白抗體scFv噬菌體文庫(kù)滴度為6.0×1014PFU/ml,抗體基因在噬菌體中表達(dá)的陽(yáng)性率達(dá)50%以上,表達(dá)的scFv片段均為輕鏈和重鏈的雜合體,可較好的重現(xiàn)可變區(qū)的多樣性。結(jié)論已成功構(gòu)建了人源尖吻蝮蛇毒蛋白抗體scFv噬菌體文庫(kù),為下一步噬菌體文庫(kù)的克隆構(gòu)建和篩選奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective to construct a phage library of human Agkistrodon acutus venom single chain variable region (scFv) antibody. Methods Trizol reagent was used to extract the total RNAs from the peripheral blood lymphocytes of the convalescent patients after bitten by Agkistrodon acutus. The total mRNAs were purified by Oligotex mRNA Mini Kits and synthesized by reverse transcription. A series of specific primers were designed for the genes of light chain and heavy chain variable region of human antibody. Using the synthesized total cDNA as template, the variable region gene library of light chain and heavy chain of antibody was amplified, then the light chain and heavy chain of scFv library were spliced by overlapping extension of PCR(splicing by overlap extension PCRnSOE-PCR.The scFv gene was digested by double enzyme and inserted into the framework of T7 phage for packaging. The scFv phage library of snake venom antibody (scFv) was established by four rounds of panning with Agkistrodon acutus snake venom protein antigen. The titer of scFv phage library was detected by plaque method and PCR and sequencing were carried out. Results the scFv library was successfully constructed by the combination of light chain and heavy chain variable region gene library, the titer of scFv phage library of snake venom antibody was 6.0 脳 10 14 PFU / ml, and the positive rate of antibody gene expression in phage was over 50%. The expressed scFv fragments were heterozygous of light chain and heavy chain, which could reproduce the diversity of variable region. Conclusion the scFv phage library of human Agkistrodon acutus venom antibody has been successfully constructed, which lays a foundation for the cloning and screening of the next phage library.
【作者單位】： 第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院急救部;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(81071537) 重慶市科技攻關(guān)項(xiàng)目(CSTC\2010AC5026) 第三軍醫(yī)大學(xué)臨床創(chuàng)新基金(2009XLC15)資助
【分類號(hào)】：R392.1

【共引文獻(xiàn)】

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【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1831131