本文選題：丙型肝炎 + NS5A　； 參考：《鄭州大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 背景和目的 丙型肝炎病毒(HCV)屬黃病毒科，主要經(jīng)血傳播的肝炎病毒。可引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌，對人類健康危害極大。目前世界上有1.7億人感染。病毒主要感染肝細胞，然而有研究表明丙型肝炎病毒也可能感染其他類型的細胞，比如B細胞，單核巨噬細胞，和樹突狀細胞，從而導(dǎo)致免疫功能異常。了解HCV作用于肝細胞和肝外細胞的分子生物學(xué)基礎(chǔ)對揭示丙肝的發(fā)病和慢性化機制非常關(guān)鍵。HCV基因組轉(zhuǎn)錄翻譯為一條多肽前體，，在信號肽酶和蛋白酶的作用下裂解為10個蛋白，包括Core、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。NS5A是非結(jié)構(gòu)蛋白的一種(HCV-1b型有447個氨基酸殘基)，C-末端絲氨酸被磷酸化后形成基礎(chǔ)磷酸化的NS5A蛋白。在NS4A蛋白依賴的模式下，NS5A蛋白中央的絲氨酸被磷酸化，形成高度磷酸化的NS5A蛋白。NS4A蛋白結(jié)合并支配NS5A蛋白的高度磷酸化。盡管NS5A在病毒復(fù)制中的作用還未搞清，然而卻發(fā)現(xiàn)NS5A上的一段區(qū)域(氨基酸2209到2248)與干擾素治療的敏感性有關(guān)。此區(qū)已命名為干擾素(IFN，interferon)敏感決定區(qū)(ISDR)。對判斷干擾素的療效很有幫助。另一方面，NS5A蛋白可和PKR催化結(jié)構(gòu)域直接相互作用，抑制其活性。在體內(nèi)，NS5A蛋白可破壞雙鏈RNA激活的蛋白激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase PKR)的二級結(jié)構(gòu)。抑制PKR介導(dǎo)的eIFalpha磷酸化。但NS5A蛋白是否參與了感染細胞抵抗IFN的抗病毒效應(yīng)仍未明了。研究表明，缺失N-末段129-146氨基酸殘基的NS5A蛋白有較強的反式激活作用。NSSA的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域包括兩個酸性氨基酸區(qū)(2 143-2 184 2 220-2 273氨基酸殘基)和一個脯氨酸富集區(qū)(2 282-2 327氨基酸殘基)，這些區(qū)域被認為是NS5A的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域。對NS5A進行研究，找出NS5A在肝細胞中的表達對肝細胞基因表達譜產(chǎn)生的影響，并進一步弄清具體作用機制、作用效應(yīng)及連帶影響，對明確HCV的致病機制，尋找有效防治方法具有重要意義。 方法 1．根據(jù)文獻[6]及NCBI的Genbank上公布的HCV-1b型基因序列，設(shè)計PCR產(chǎn)物片段包含NS5A的特異性引物，以從病人血清中提取的以HCV-1b型RNA為模板，，利用RT-PCR方法擴增出1632bp片段，連接至pGEM-T載體并送測序，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計PCR產(chǎn)物為NS5A的特異性引物，以上述連接至pGEM-T載體1632bp片段為模板擴增出1341bp片段，連接至pGEM-T載體并送測序。2．將上述引入酶切位點EcoRV和HindⅢ的pGEM-T-NS5A和pET32a(+)空質(zhì)粒經(jīng)EcoRV和HindⅢ雙酶切，酶切片段回收后連接，測序正確后轉(zhuǎn)化BL21宿主菌，0.5mM／ml IPTG、30℃誘導(dǎo)5hr，3．根據(jù)1的測序結(jié)果設(shè)計NS5A缺失突變型1特異性引物，引入酶切位點KpnⅠ和HindⅢ，以pGEM-T-NS5A質(zhì)粒為模板，PCR擴增出591bp片段，插入至真核表達載體pcDNA3。1(-)／myc中，測序完全正確，表明NS5A缺失突變型1真核表達載體的構(gòu)建成功。4．用3構(gòu)建的pcDNA3。1／myc-His(-)A-NS5ADM1真核表達重組質(zhì)粒，與空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞并獲得表達，兩者互為平行對照，提取轉(zhuǎn)染后的細胞總RNA，應(yīng)用基因表達譜芯片技術(shù)檢測HepG2在NS5A缺失突變體轉(zhuǎn)染后差異表達的基因譜的變化。 結(jié)果 1．NS5A測序結(jié)果和NCBI上NS5A序列比對后，有91.4％的同源性，表明NS5A已克隆成功。2．Western blotting檢測結(jié)果顯示我們獲得了帶有組氨酸標簽的重組融合蛋白的優(yōu)化表達。3．NS5A缺失突變型測序結(jié)果表明NS5A已克隆成功。4．篩選獲得了3條已知的反式上調(diào)基因，10條已知的反式下調(diào)基因。 結(jié)論 1．成功克隆了NS5A基因，NS5A成功表達為今后單抗和多抗的制備奠定了基礎(chǔ)。2．NS5A缺失突變體上調(diào)基因為①．細胞質(zhì)膜鈣離子轉(zhuǎn)運ATP酶2；②．引發(fā)酶多肽；③．環(huán)指蛋白185。下調(diào)基因包括①Hbrm基因；②SCL／TAL1阻斷基因座；③核糖核苷二磷酸還原酶M2鏈相似蛋白；④鋅指蛋白253；⑤白介素2增強結(jié)合因子(ILF2)；⑥U2相關(guān)SR40蛋白；⑦神經(jīng)母細胞瘤擴增蛋白；⑧酸性鈣通道；⑨大電導(dǎo)鈣激活鉀通道；⑩ralA結(jié)合蛋白1(RALBP1)等。結(jié)果提示NS5Adm1與DNA和RNA復(fù)制合成過程、離子通道蛋白，腫瘤細胞的形成和細胞凋亡有關(guān)。3．上述研究為進一步開展NS5A的生物學(xué)活性研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，以及為研究其在體內(nèi)存在的調(diào)控機制提供了線索和依據(jù)。
[Abstract]:Background and Purpose






Hepatitis C virus ( HCV ) is a kind of hepatitis virus which is mainly transmitted by blood and blood . It can cause chronic hepatitis , liver cirrhosis and liver cancer . It is very important to human health . It is suggested that NS5A protein can infect other types of cells , such as B cells , mononuclear phagocytes , and dendritic cells . It is suggested that NS5A protein can infect other types of cells , such as B cells , mononuclear phagocytes and dendritic cells .






method






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本文編號：1826055