本文選題：SARS-CoV + ORF7a�。� 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2006年碩士論文

【摘要】：SARS是近年來爆發(fā)的一種嚴(yán)重的呼吸道傳染疾病，SARS-CoV是SARS的病原體�；蚪M測序結(jié)果顯示，SARS-CoV除編碼冠狀病毒共有的結(jié)構(gòu)蛋白M、E、S和N蛋白外，還存在6個(gè)編碼氨基酸大于50的ORFs，，生物信息學(xué)分析沒有發(fā)現(xiàn)這些ORFs的同源基因，推測其中可能存在SARS-CoV致病基因。在SARS-CoV特有的這些ORFs中，ORF7a即為其中之一。已有文獻(xiàn)報(bào)道在SARS-CoV感染的細(xì)胞中可檢測到ORF7a的表達(dá)，且其表達(dá)能誘導(dǎo)caspase依賴性的細(xì)胞凋亡，因此有理由認(rèn)為7a可能是SARS-CoV的潛在致病基因。本課題擬對(duì)7a蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能初步研究，以期為揭示SARS-CoV致病的分子機(jī)制提供線索。 我們用免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)7a的細(xì)胞內(nèi)定位及拓?fù)洚悩?gòu)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其定位于高爾基體，N端朝胞漿，C端朝內(nèi)腔。同時(shí)我們在實(shí)驗(yàn)中注意到轉(zhuǎn)染了7a的HEK293細(xì)胞與空細(xì)胞相比，增殖變得緩慢，推測其可能有增殖抑制作用。于是構(gòu)建了N端或C端帶有GFP或myc標(biāo)簽的7a真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞系后檢測細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)7a的表達(dá)可明顯抑制細(xì)胞增殖，阻止BrdU摻入，提示7a可能起到細(xì)胞周期調(diào)控的作用。于是我們將7a轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24-60h分別用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)，7a的表達(dá)均能引起細(xì)胞周期G0／G1期阻滯，且轉(zhuǎn)染COS-7和Vero細(xì)胞也可觀察到相似結(jié)果。 為了找到7a中影響其定位和功能的結(jié)構(gòu)域，我們構(gòu)建了7a基因的系列缺失突變體，并對(duì)其進(jìn)行定位和相關(guān)功能分析，發(fā)現(xiàn)決定7a定位和引起細(xì)胞G0／G1期阻滯以及凋亡的區(qū)域均位于蛋白的44-82個(gè)氨基酸處。 最后，進(jìn)一步探索7a引起細(xì)胞G0／G1期阻滯的機(jī)制。Rb是細(xì)胞由G0／G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)控因子，可結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2F并抑制其活性。Rb磷酸化受Cyclin／cdk復(fù)合物的調(diào)節(jié)，Rb高磷酸化后釋放并激活E2F，啟動(dòng)S期基因轉(zhuǎn)錄。實(shí)驗(yàn)中我們主要通過Western blot的方法對(duì)這些影響細(xì)胞周期進(jìn)程的蛋白因子進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在HEK293細(xì)胞中，7a的表達(dá)可顯著降低Cyclin D3轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表
[Abstract]:SARS is a serious respiratory infectious disease in recent years. SARS-CoV is the pathogen of SARS. The results of genomic sequencing showed that there were six ORFs encoding amino acids more than 50 in addition to the structural proteins Mannes and N shared by SARS-CoV. The homologous genes of these ORFs were not found in bioinformatics analysis. It is speculated that there may be SARS-CoV pathogenic gene. ORF 7 a is one of these ORFs specific to SARS-CoV. It has been reported that the expression of ORF7a can be detected in SARS-CoV infected cells, and its expression can induce apoptosis of caspase dependent cells. Therefore, it is reasonable to think that 7a may be a potential pathogenicity gene of SARS-CoV. The aim of this study is to study the structure and function of 7a protein in order to provide clues for the molecular mechanism of SARS-CoV pathogenesis. The intracellular localization and topological isomerism of 7a were studied by immunocytochemistry. It was found that it was located in the C-terminal cavities of the cytoplasm of Golgi. At the same time, we observed that the proliferation of HEK293 cells transfected for 7 years was slower than that of empty cells. A 7a eukaryotic expression vector with GFP or myc tags on N-terminal or C-terminal was constructed. After transfection of different cell lines, cell proliferation was detected. It was found that 7a expression could significantly inhibit cell proliferation and prevent BrdU incorporation. These results suggest that 7 a may play a role in cell cycle regulation. So we transfected HEK293 cells for 7 years and analyzed the cell cycle by flow cytometry at 24-60 hours after transfection. The results showed that the expression of 7a at different time points after transfection could induce the arrest of G0/G1 phase of cell cycle. Similar results were observed after transfection of COS-7 and Vero cells. In order to find out the domain of 7a gene that affects its location and function, we constructed a series of deletion mutants of 7a gene, and analyzed its location and related functions. It was found that the regions determining 7a localization, G0/G1 arrest and apoptosis were located at the 44-82 amino acids of the protein. Finally, the mechanism of cell G0/G1 phase arrest induced by 7a was further explored. RB is the key regulatory factor for cell to enter S phase from G0/G1 phase. Binding to transcription factor E2F and inhibition of its activity. RB phosphorylation is regulated by Cyclin/cdk complex and release and activation of E2F after high Rb phosphorylation. In our experiment, we studied these protein factors that affect cell cycle progression by Western blot. We found that the expression of T7a in HEK293 cells could significantly reduce the transcription level and protein surface of Cyclin D3.
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：1823607