本文選題：KLHL蛋白 + E泛素連接酶　； 參考：《中國病理生理雜志》2014年05期

【摘要】：目的:克隆人BTB-Kelch家族蛋白KLHL32編碼基因并初步鑒定其在細(xì)胞中的功能。方法:采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析Toll樣受體5(Toll-like receptor 5,TLR5)特異性激活劑鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白(flagllin from S.typhimurium,ST-FLA)刺激經(jīng)佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)誘導(dǎo)分化的THP-1巨噬細(xì)胞中KLHL32 mRNA表達(dá)水平的變化,應(yīng)用RT-PCR克隆人KLHL32編碼區(qū)的cDNA序列并將其克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1,采用螢光素酶雙報(bào)告基因表達(dá)系統(tǒng)分析KLHL32過表達(dá)對轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(NF-κB)活性的影響,并采用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析了KLHL32與Cul-3蛋白在細(xì)胞內(nèi)的相互結(jié)合。結(jié)果:ST-FLA(100μg/L)刺激經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化的THP-1巨噬細(xì)胞4 h引起KLHL32 mRNA的表達(dá)水平下調(diào);成功克隆了人KLHL32基因并將其克隆至真核表達(dá)載體中獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.1-KLHL32-FLAG,在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)KLHL32蛋白對TNF-α誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活沒有明顯影響,但KLHL32可通過其氨基端的BTB結(jié)構(gòu)域與Cul-3相互結(jié)合。結(jié)論:成功鑒定了人KLHL32蛋白,其通過BTB結(jié)構(gòu)域與Cul-3蛋白相互結(jié)合,可能是一種潛在的E3泛素連接酶,證實(shí)了TLR5受體激活可誘導(dǎo)其表達(dá)水平的下調(diào),提示KLHL32蛋白在細(xì)胞中可能參與炎癥細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控。
[Abstract]:Aim: to clone the gene encoding human BTB-Kelch family protein KLHL32 and to identify its function in cells. Methods: the expression of KLHL32 mRNA in THP-1 macrophages induced by phorbol 12-myristate 13-acetatePMA-induced by flagellin from S.typhimurium ST-FLAwas analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR (PCR), a specific activator of Toll receptor 5(Toll-like receptor 5 (TLR5), in Salmonella typhimurium. The cDNA sequence of human KLHL32 coding region was cloned by RT-PCR and cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1. the effect of KLHL32 overexpression on the activity of transcription factor nuclear factor 魏 B (NF- 魏 B) NF- 魏 B was analyzed by using fluorescent enzyme double reporter gene expression system. The binding of KLHL32 and Cul-3 protein in cells was analyzed by immunoprecipitation assay. Results the expression of KLHL32 mRNA in THP-1 macrophages induced by PMA was down-regulated by 1: ST-FLA-100 渭 g / L stimulation for 4 h. Human KLHL32 gene was successfully cloned and cloned into eukaryotic expression vector to obtain recombinant plasmid pcDNA3.1-KLHL32-FLAG. Overexpression of KLHL32 protein in HEK293 cells had no significant effect on the activation of transcription factor NF- 魏 B induced by TNF- 偽. However, KLHL32 can bind to Cul-3 through the BTB domain of its amino terminal. Conclusion: human KLHL32 protein has been successfully identified. It may be a potential E3 ubiquitin ligase through the interaction of BTB domain with Cul-3 protein, which indicates that the activation of TLR5 receptor can induce the down-regulation of its expression level. These results suggest that KLHL32 protein may be involved in the regulation of signal transduction in inflammatory cells.
【作者單位】： 南方醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室 廣東省功能蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81070955)
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陳建明,余應(yīng)年;真核泛素綴合途徑研究進(jìn)展[J];中國病理生理雜志;2000年02期

2 張峗;戴翠蓮;;泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在心肌梗死中的病理生理意義[J];中國病理生理雜志;2010年06期

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 唐亮;鄢和新;劉瓊;唐善花;王紅陽;;人信號調(diào)節(jié)蛋白α單克隆抗體的制備及初步應(yīng)用[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2010年08期

2 胡宗海;低氧與應(yīng)激蛋白研究進(jìn)展[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2003年18期

3 賴燕;徐波;林明;王育娜;曹蕾;賀俐;劉萍;何水林;;辣椒泛素交聯(lián)酶cDNA的分離及其在UV-B作用下的表達(dá)分析[J];福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2008年02期

4 林萍;姚小華;曹永慶;龍偉;王開良;滕建華;;普通油茶泛素結(jié)合酶UBE2-J2的cDNA序列及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析[J];林業(yè)科學(xué)研究;2013年06期

5 易樂飛;劉楚吾;王萍;周向紅;;條斑紫菜泛素結(jié)合酶基因的cDNA序列克隆與分析[J];水產(chǎn)學(xué)報(bào);2009年05期

6 馮立;;運(yùn)動訓(xùn)練對自發(fā)性高血壓大鼠心肌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響[J];沈陽體育學(xué)院學(xué)報(bào);2011年03期

7 陳建文;周婷;榮懌;周蕓;崔秀青;郭嘉麗;鄧菁;田峰;陳衛(wèi)紅;;金屬礦山和陶瓷廠生產(chǎn)性粉塵的致炎性反應(yīng)[J];華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2012年03期

8 廖興江;戴佳琳;黃江;胡旭初;余新炳;申萍香;周靈貴;郎書源;;亞洲牛帶絳蟲泛素綴合酶E2的克隆表達(dá)及免疫鑒定[J];西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2009年04期

9 衛(wèi)萍;成軍;楚庸烈;倫永志;張黎穎;洪源;;應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選與前S1蛋白反式激活蛋白3結(jié)合的肝細(xì)胞蛋白基因[J];新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2010年04期

10 陳建明,余應(yīng)年,陳星若;反義阻斷hMMS2基因表達(dá)以抑制細(xì)胞生長[J];中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志;2000年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前9條

1 劉興樓;固有免疫細(xì)胞AIM2炎性體通路在抗HCMV免疫機(jī)制中的作用[D];華中科技大學(xué);2011年

2 馬思遠(yuǎn);抗內(nèi)毒素IgY拮抗內(nèi)毒素?fù)p害相關(guān)機(jī)制的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2010年

3 陳建明;運(yùn)用反義策略對人的兩個(gè)突變相關(guān)基因hMMS2和CROC-1功能的初步研究[D];浙江大學(xué);2001年

4 趙寶存;小麥T型CMS恢復(fù)基因的遺傳分析及育性相關(guān)基因的克隆與功能研究[D];河北師范大學(xué);2005年

5 吳瀟;豬泛素—蛋白酶體途徑定位、序列及性狀關(guān)聯(lián)分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

6 郭啟芳;改善泛素系統(tǒng)提高植物逆境適應(yīng)性研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

7 丁庭波;鞘磷脂合酶異常表達(dá)與細(xì)胞凋亡關(guān)系的探討[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

8 周淑梅;小麥F-box蛋白基因TaFBA1的分離與功能分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

9 姚振宇;TRAIL誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡和自噬的分子機(jī)制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前9條

1 王錚;S5a/angiocidin誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1分化的機(jī)制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

2 韓巧玲;大豆重要抗逆相關(guān)基因GmE2、GmNAC2a的特性分析及功能鑒定[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

3 葉金善;環(huán)氧化酶-2/前列腺素E_2在血管緊張素Ⅱ刺激巨噬細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子中的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2010年

4 劉宏;血管緊張素Ⅱ通過NF-κB上調(diào)巨噬細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2010年

5 王國坤;過表達(dá)小麥泛素基因Ta-Ub2加快煙草發(fā)育進(jìn)程機(jī)制的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

6 李廣起;龍須菜泛素激活酶和泛素結(jié)合酶基因克隆及熱激下表達(dá)模式分析[D];中國海洋大學(xué);2012年

7 呂娟;蛋白酶體抑制劑的定量構(gòu)效關(guān)系及分子設(shè)計(jì)研究[D];重慶大學(xué);2012年

8 許建華;MD-2模擬肽在RAW264.7細(xì)胞膜上相互作用蛋白的釣取及篩選鑒定[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

9 周鴻飛;S5a結(jié)合死亡受體6，通過激活NF-κB信號通路誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1的分化[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2013年

【二級參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 戴翠蓮;羅開良;;泛素-蛋白酶體系統(tǒng)與動脈粥樣硬化性疾病的發(fā)生[J];國際心血管病雜志;2006年03期

，

本文編號：1803404