本文選題：硫化氫 + 硫氫化鈉��； 參考：《復(fù)旦大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 硫化氫(H_2S)是一種無色有臭雞蛋味的氣體，大量吸入會導(dǎo)致中毒。然而，很多種哺乳動物細胞自身能產(chǎn)生H_2S，在正常大鼠的血液中H_2S濃度達到46μmol／L。體內(nèi)的H_2S主要通過含硫氨基酸的代謝產(chǎn)生，胱硫醚-β-合酶(cystathionineβ-synthase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionineγ-lyase，CSE)是兩個能分解L-半胱氨酸產(chǎn)生硫化氫的酶，前者主要存在于腦和神經(jīng)系統(tǒng)，后者分布于心血管系統(tǒng)中。研究發(fā)現(xiàn)，生理濃度的H_2S能夠增加NMDA受體的敏感性，誘導(dǎo)海馬的長時程增強。在心血管系統(tǒng)中，H_2S能開放ATP敏感的鉀離子(K_(ATP))通道，使血管平滑肌舒張，降低血壓；體內(nèi)H_2S生成減少與自發(fā)性高血壓的形成有密切關(guān)系；外源性給予H_2S能有效保護心肌的缺血性損傷。由于能在體內(nèi)產(chǎn)生，并具有多種生理功能，H_2S成為繼NO和CO后的第三個氣體信號分子。 血管新生是指在原有血管基礎(chǔ)上長出新的毛細血管，，這是一個普遍的生理和病理過程，存在于組織生長發(fā)育和修復(fù)過程中，腫瘤生長也與其關(guān)系密切，因而調(diào)節(jié)血管新生具有重要的臨床應(yīng)用價值。NO和CO都被報道參與血管新生的調(diào)控，而這兩者與H_2S又存在著互相調(diào)節(jié)的關(guān)系，因此我們設(shè)想H_2S是否也能影響血管新生?然而目前在心血管方面對H_2S的研究大多集中在血壓調(diào)節(jié)和對平滑肌細胞的作用上，在內(nèi)皮細胞和血管新生領(lǐng)域，H_2S的作用尚無人報道。因此通過我們對H_2S在血管新生方面的探討，將更完善地認識這個新的氣體信號分子。 首先，檢測內(nèi)皮細胞上CSE和CBS的表達。我們選用三種不同種屬、不同來源的內(nèi)皮細胞：原代培養(yǎng)的大鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞(CMEC)以及ATCC收錄的細胞株恒河猴脈絡(luò)膜微血管內(nèi)皮細胞RF／6A和小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞bEnd.3，分別設(shè)計CSE、CBS以及管家基因的上下游引物，用RT-PCR的方法進行檢測。結(jié)果顯示三種內(nèi)皮細胞都擴增出CSE基因相應(yīng)的特異條帶，而CBS基因則都未擴增出相應(yīng)產(chǎn)物，說明內(nèi)皮細胞上存在CSE基因的表達。接著分別用兔抗CSE和CBS多克隆抗體對CMEC進行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)CSE抗體染色為陽性，CBS抗體染色為陰性，說明內(nèi)皮細胞能夠表達CSE蛋白。這是首次發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞上存在CSE的表達，提示H_2S可能在內(nèi)皮細胞上發(fā)揮一些生理學(xué)功能。 其次，研究H_2S對內(nèi)皮細胞的作用以及對體外血管新生的影響。用MTT法研究發(fā)現(xiàn)高濃度(500-1000μmol／L)的H_2S供體硫氫化鈉(NaHS)使細胞活力顯著下降，而低濃度(1-200μmol／L)則對細胞活力沒有影響，說明高濃度的H_2S可能存在細胞毒性。接著用BrdU摻入法檢測低濃度H_2S對細胞增殖的影響，結(jié)果顯示10和20μmol／L的NaHS能促進細胞增殖。然后檢測了H_2S對內(nèi)皮細胞粘附、遷移以及管腔形成的影響，結(jié)果表明低濃度H_2S不同程度地促進了細胞的粘附、遷移以及管腔形成能力。說明H_2S能促進體外的血管新生。 我們進一步探討了H_2S促進體外血管新生的機制。Western blot顯示H_2S能促進細胞內(nèi)信號分子Akt的磷酸化，并具有時間和濃度依賴性，用PI3K(Akt上游信號分子)的阻斷劑wortmannin或LY 294002能夠阻斷這種效應(yīng)。預(yù)先給予內(nèi)皮細胞PI3K的阻斷劑或者用顯性負表達的Akt質(zhì)粒(DN-Akt)轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞，H_2S的促進細胞遷移和管腔形成的效應(yīng)被阻斷。說明H_2S促進體外血管新生可能通過PI3K／Akt通路。對于另兩個信號分子Erk和p38，H_2S未能促進其磷酸化。進一步研究發(fā)現(xiàn)，H_2S使Akt的下游信號存活素(survivin)蛋白表達增加，后者能促使細胞存活，促進血管新生。另外，我們還檢測了整合素(integrin)的表達情況，發(fā)現(xiàn)H_2S能促進整合素α2和β1的表達，而對整合素α1、αv、β3和β5沒有明顯影響。 最后，研究H_2S對體內(nèi)血管新生的影響。采用C57小鼠的皮下注射基底膜抽提物形成基質(zhì)栓(Matrigel plug)模型，通過對Matrigel plug切片的HE和Masson三色染色，發(fā)現(xiàn)H_2S使Matrigel plug中細胞浸潤增加，血管樣結(jié)構(gòu)增多。對內(nèi)皮細胞特異性標志物CD 31進行免疫組化染色，證實浸潤的細胞大多為內(nèi)皮細胞，且圍成很多管腔樣結(jié)構(gòu)。進一步用TMB比色法測定顯示H_2S使Matrigel plug中的血紅蛋白含量增加。以上結(jié)果說明H_2S能促進體內(nèi)的血管新生。 此外，我們還構(gòu)建了持續(xù)過表達和顯性負表達的survivin質(zhì)粒，為今后進一步研究H_2S的作用機制打下基礎(chǔ)。 總之，我們在實驗中發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞上存在CSE的表達，H_2S能促進體內(nèi)外的血管新生，這種作用可能與激活PI3K／Akt信號通路相關(guān)。
[Abstract]:Hydrogen sulfide (H_2S) is a colorless and odorless egg flavored gas. A large amount of inhalation can cause poisoning. However, many species of mammalian cells themselves produce H_2S. In normal rat blood, the concentration of H_2S in the blood of 46 Mu mol / L. is mainly produced by the metabolism of sulphur containing amino acids, and cystthioether beta synthase (cystathionine beta -synthase, CBS). And cystthioether - gamma lyase (cystathionine gamma -lyase, CSE) is the two enzyme that can decompose L- cysteine to produce hydrogen sulfide, the former mainly exists in the brain and nervous system, and the latter is distributed in the cardiovascular system. The study found that the physiological H_2S can increase the sensitivity of the NMDA receptor and induce the long term enhancement of the hippocampus. H_2S can open the ATP sensitive potassium ion (K_ (ATP)) channel to relax the vascular smooth muscle and reduce blood pressure, and the decrease of H_2S in the body is closely related to the formation of spontaneous hypertension; exogenous H_2S can effectively protect the ischemic injury of the myocardium. Because it can be produced in the body and has many physiological functions, H_2S becomes after NO and CO. Third gas signal molecules.
Angiogenesis refers to the growth of new capillaries on the basis of the original blood vessels. This is a common physiological and pathological process. In the process of tissue growth and repair, the growth of the tumor is closely related. Therefore, the important clinical value of regulating angiogenesis,.NO and CO, is reported to be involved in the regulation of angiogenesis. There is a regulatory relationship with H_2S, so do we think that H_2S can also affect angiogenesis? However, the current cardiovascular research on H_2S is mostly focused on the regulation of blood pressure and the effect on smooth muscle cells. There is no report on the role of H_2S in the field of endothelial cells and angiogenesis. Therefore, H_ The discussion of 2S in angiogenesis will further understand this new gas signal molecule.
First, we detected the expression of CSE and CBS on endothelial cells. We selected three different species, different sources of endothelial cells: primary cultured rat cardiac microvascular endothelial cells (CMEC), and ATCC collected cell lines, Ganges RIver monkey choroidal microvascular endothelial cells RF / 6A, and mouse brain microvascular endothelial cells bEnd.3, respectively, to design CSE and CBS, respectively. The upper and lower primers of the housekeeper gene were detected by RT-PCR method. The results showed that the specific bands of the CSE gene were amplified by the three endothelial cells, while the CBS gene did not amplify the corresponding products, indicating that the CSE gene was expressed on the endothelial cells. Then, the CMEC was immunofluorescent with the Rabbit anti CSE and CBS polyclonal antibodies respectively. It was found that CSE antibody staining was positive and CBS antibody staining was negative, indicating that endothelial cells can express CSE protein. This is the first time that CSE expression exists on endothelial cells, suggesting that H_2S may play some physiological functions in endothelial cells.
Secondly, the effect of H_2S on endothelial cells and its effect on angiogenesis in vitro was studied. The MTT method was used to find that H_2S donor sodium hydrogen sulfide (NaHS) with high concentration (500-1000 u mol / L) decreased cell viability significantly, while low concentration (1-200 Mu mol / L) had no effect on cell viability, indicating that high concentration of H_2S might have cytotoxicity. The effect of low concentration of H_2S on cell proliferation was detected by BrdU incorporation, and the results showed that 10 and 20 mol / L NaHS could promote cell proliferation. Then the effects of H_2S on endothelial cell adhesion, migration and lumen formation were detected. The results showed that the low concentration of H_2S promoted cell adhesion, migration and the ability of lumen formation to varying degrees. It can promote angiogenesis in vitro.
We further explored the mechanism that H_2S promotes angiogenesis in vitro,.Western blot shows that H_2S can promote the phosphorylation of intracellular signal molecule Akt, which has time and concentration dependence, blocking this effect with PI3K (Akt upstream signal molecule) blocking agent wortmannin or LY 294002. The effect of H_2S on cell migration and cavity formation was blocked by the transfection of the dominant negative expression of Akt plasmid (DN-Akt). It shows that H_2S may promote angiogenesis in vitro through the PI3K / Akt pathway. For the other two signal molecules Erk and p38, H_2S failed to promote its phosphorylation. Further studies found that H_2S makes Akt downstream signals survive. The expression of survivin protein increased, the latter could promote cell survival and promote angiogenesis. In addition, we also detected the expression of integrin (integrin), and found that H_2S could promote the expression of integrin alpha 2 and beta 1, but there was no significant effect on integrin alpha 1, alpha v, beta 3 and beta 5.
Finally, the effect of H_2S on angiogenesis in the body was studied. The Matrigel plug model was formed by subcutaneous injection of basement membrane extracts from C57 mice. Through HE and Masson trichromatic staining of Matrigel plug slices, it was found that H_2S increased the infiltration of cells in Matrigel plug and increased the structure of vascular like. The specific marker of endothelial cells was 31. Immuno histochemical staining showed that most of the infiltrated cells were endothelial cells and were surrounded by many lumen like structures. Further TMB colorimetric assay showed that the content of hemoglobin in Matrigel plug was increased by H_2S. The above results indicated that H_2S could promote angiogenesis in the body.
In addition, we constructed a survivin plasmid with over expression and dominant negative expression, which laid the foundation for further research on the mechanism of H_2S.
In conclusion, we have found that there is an expression of CSE in the endothelial cells, and H_2S can promote angiogenesis in the body and body, which may be associated with the activation of the PI3K / Akt signaling pathway.

【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R363;R33

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