本文選題：生長相關(guān)蛋白 + 分子克隆��； 參考：《福建醫(yī)科大學(xué)》2006年碩士論文

【摘要】： 目的:應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆大鼠生長相關(guān)蛋白(rat growth associated protein-43,rGAP-43)的基因片段,并以腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus vector ,AAV)為載體構(gòu)建出rGAP-43的表達系統(tǒng),為進一步研究rGAP-43對大鼠視網(wǎng)膜中各類細(xì)胞的作用奠定基礎(chǔ),也為下一步進行基因治療的研究提供實驗依據(jù)。 方法: 1.經(jīng)RT-PCR法,獲得SD大鼠腦組織的cDNA文庫,設(shè)計引物,從中擴增出GAP-43基因的開放讀碼框區(qū)(open reading frame,ORF)基因片段,克隆入T載體,經(jīng)DNA序列測定正確后,再大量擴增rGAP-43基因片段。 2.同時將報告基因—綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein ,EGFP)經(jīng)SalⅠ/BglⅡ酶切后連接上經(jīng)同樣酶切AAV-MCS多克隆載體,重組命名為AAV-EGFP,進行酶切鑒定與DNA序列測定。 3.將目的基因rGAP-43經(jīng)BamHⅠ/SalⅠ酶切后連接上經(jīng)同樣酶切的含EGFP報告基因的AAV質(zhì)粒載體(AAV-EGFP)。重組表達質(zhì)粒命名為AAV-EGFP-rGAP-43,隨后針對重組表達質(zhì)粒AAV-EGFP-rGAP-43進行酶切、DNA序列測定等結(jié)構(gòu)上的鑒定。 4.將重組表達質(zhì)粒及AAV轉(zhuǎn)染需要的輔助質(zhì)粒pHelper、pAAV-RC經(jīng)脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)好的AAV-293細(xì)胞,進行熒光表達的檢測以及病毒的包裝、病毒原液的收集及病毒感染性滴度的測定等。 結(jié)果:. 1.克隆出的rGAP-43基因的ORF區(qū)片段以及構(gòu)建的AAV-EGFP-rGAP-43重組表達質(zhì)粒,兩者經(jīng)DNA序列測定,所測序列與GeneBank檢索的完全一致。. 2.重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的AAV-293細(xì)胞可檢測到報告基因綠色熒光的表達,根據(jù)表達熒光的細(xì)胞數(shù)得到重組病毒的感染性滴度為106 particles/ml。 結(jié)論: 1.應(yīng)用分子生物學(xué)方法可以成功地克隆大鼠GAP-43基因并構(gòu)建以腺相關(guān)
[Abstract]:Objective: to clone the gene fragment of rat growth associated protein-43 (growth associated protein-43) by molecular biology, and construct the expression system of rGAP-43 using adeno-associated virus vector (AAVV) as vector.It lays a foundation for further study of the effect of rGAP-43 on various kinds of cells in rat retina and provides experimental basis for the further study of gene therapy.Methods: 1.The cDNA library of brain tissue of SD rats was obtained by RT-PCR method. Primers were designed to amplify the open reading frame (ORF) gene fragment of GAP-43 gene and cloned into T vector. The rGAP-43 gene fragment was amplified by DNA sequencing.2.At the same time, the reporter gene, enhanced green fluorescence protein (EGFP), was digested by Sal 鈪，

本文編號：1764650