本文選題：胰島素受體激酶 + STAT5b��； 參考：《西華大學(xué)》2006年碩士論文

【摘要】：目的 根據(jù)胰島素受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,構(gòu)建STAT5b應(yīng)答元件靶控報(bào)告基因的細(xì)胞模型,通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)水平間接監(jiān)測(cè)胰島素受體(IR)激酶活性,從而為高通量地篩選出以IR激酶為靶標(biāo)的藥物提供新的細(xì)胞模型。 方法 (1)轉(zhuǎn)染方案的選擇:通過(guò)對(duì)pEGFP-3與脂質(zhì)體不同的轉(zhuǎn)染比例,轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞表達(dá)GFP效率比較,確定最佳的轉(zhuǎn)染方案。(2)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的建立和驗(yàn)證:STAT5b靶控報(bào)告基因(聯(lián)合或不聯(lián)合IR基因及聯(lián)合或不聯(lián)合STAT5b基因)對(duì)HepG2細(xì)胞或CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染,檢測(cè)胰島素對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞STAT5b靶控報(bào)告基因表達(dá)的影響,并比較分析聯(lián)合或不聯(lián)合IR基因及聯(lián)合或不聯(lián)合STAT5b基因?qū)?xì)胞模型靈敏性的影響,選擇最佳的細(xì)胞轉(zhuǎn)染模型。(3)考察胰島素對(duì)細(xì)胞模型的量效和時(shí)效的關(guān)系。(4)通過(guò)IR激酶抑制劑考察細(xì)胞模型的特異性。(5)通過(guò)Z′因子考察細(xì)胞模型的穩(wěn)定性。(6)利用MTT法考察胰島素對(duì)細(xì)胞增殖功能的影響。 結(jié)果 (1)用pEGFP-C3轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞來(lái)確定質(zhì)粒DNA與lipofectamine~(TM)2000最佳轉(zhuǎn)染方案為質(zhì)粒DNA(μg):lipofectamine~(TM)2000(μ1)=1:2。(2)HepG2細(xì)胞株與質(zhì)粒組合的考察,結(jié)果表明轉(zhuǎn)染外源性的人胰島素受體pRC/CMV·hIR質(zhì)�？梢燥@著提高細(xì)胞模型的靈敏度。(3)CHO細(xì)胞株與質(zhì)粒組合的考察,結(jié)果表明STAT5b蛋白在誘導(dǎo)Luc表達(dá)中發(fā)揮著重要作用的,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)共轉(zhuǎn)染pBS-SK-STAT5b質(zhì)�？梢赃_(dá)到此目的。分析比較兩種細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)選用pSTAT5b_3-TK-LUC、pSV-μ-Gal、DRC/CMV·hIR與pBS-SK-STAT5b四種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞建立細(xì)胞模型。在10~(-7)mol/L胰島
[Abstract]:Aim to construct a cell model of target control reporter gene of STAT5b response element according to the signal transduction pathway mediated by insulin receptor, and to indirectly monitor the activity of insulin receptor (IRR) kinase by detecting the expression level of reporter gene.This provides a new cell model for high throughput screening of IR kinase targeted drugs.Methods 1) selection of transfection scheme: the efficiency of GFP expression in HepG2 cells was compared by different transfection ratio of pEGFP-3 and liposome.Establishment and verification of the cell model of transfection with the optimal transfection method. The transfection of HepG2 cells or CHO cells by the target control reporter gene (combined or not combined IR gene and combined or uncombined STAT5b gene) was verified.To detect the effect of insulin on the expression of target control reporter gene in STAT5b transfected cells, and to compare and analyze the effects of combined or uncombined IR gene and combined or uncombined STAT5b gene on the sensitivity of the cell model.Select the best cell transfection model. (3) investigate the relationship between the dose effect of insulin on the cell model and the effect of time. 4) examine the specificity of the cell model by IR kinase inhibitor. 5) study the stability of the cell model by Z' -factor.The effect of insulin on cell proliferation was investigated by MTT.Results 1) pEGFP-C3 transfection of HepG2 cells was used to determine that the optimal transfection scheme of plasmid DNA and lipofectamine~(TM)2000 was the combination of plasmid DNA (渭 g: lipofectamine2) TM2000 (渭 1)=1:2.(2)HepG2 cell line) and plasmid.The results showed that transfection of exogenous human insulin receptor pRC/CMV hIR plasmid could significantly improve the sensitivity of the cell model. The results showed that STAT5b protein played an important role in the induction of Luc expression.This experiment can achieve this goal by co-transfection of pBS-SK-STAT5b plasmid.The results of two cell lines were analyzed and compared. The cell model was established by co-transfection of pSTAT5bti3-TK-LUCnpSV- 渭 -Gal-DRC / CMV hIR and pBS-SK-STAT5b into CHO cells.In 10~(-7)mol/L islets
【學(xué)位授予單位】：西華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類(lèi)號(hào)】：R-331

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本文編號(hào)：1762092