本文選題：陰道毛滴蟲(chóng) + TvRab1鳥(niǎo)苷堿磷酸酶��； 參考：《汕頭大學(xué)》2006年碩士論文

【摘要】：研究目的 (1)克隆和分析原生動(dòng)物陰道毛滴蟲(chóng)(Trichomonas vaginalis)兩個(gè)Rab1鳥(niǎo)苷三磷酸酶(Guanosine Triphosphate，GTP)同源基因：TvRab1a和TvRab1-like；構(gòu)建pQE80L／TvRab1a和pQE80L／TvRab1-like原核表達(dá)重組質(zhì)粒并表達(dá)融合蛋白。(2)對(duì)這兩個(gè)TvRab1蛋白進(jìn)行陰道毛滴蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)定位，初步確定其功能。 材料與方法 (1)從陰道毛滴蟲(chóng)構(gòu)建的cDNA表達(dá)文庫(kù)中分離出兩個(gè)TvRab1的同源基因，測(cè)序并對(duì)其序列保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行同源性分析。用PCR方法擴(kuò)增基因組DNA，并進(jìn)行測(cè)序及序列分析。(2)將兩段目的基因分別克隆至原核表達(dá)載體pQE80L中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E．coli M15感受態(tài)細(xì)胞，在異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)誘導(dǎo)下表達(dá)目的基因融合蛋白；Ni-NTA親和層析純化表達(dá)產(chǎn)物，SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物的分子量及純化效果。(3)用純化并復(fù)性的融合蛋白分別免疫豚鼠，獲得重組蛋白抗血清；采用Western blot法對(duì)抗體特異性進(jìn)行分析鑒定。(4)利用所得抗體進(jìn)行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)，對(duì)TvRab1a及TvRab1-like蛋白進(jìn)行陰道毛滴蟲(chóng)原蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)定位。 結(jié)果 (1)在已構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)2個(gè)Rab1鳥(niǎo)苷三磷酸酶同源基因。其中1個(gè)cDNA序列長(zhǎng)707堿基對(duì)，讀碼框含606對(duì)堿基，推測(cè)蛋白質(zhì)序列含有202個(gè)氨基酸。序列分析表明該氨基酸序列與Rab1a蛋白亞家族的同源性最高，我們將其命名為TvRab1a。另一cDNA序列長(zhǎng)717對(duì)堿基，讀碼框含603對(duì)堿基，推測(cè)蛋白質(zhì)序列具200個(gè)氨基酸。序列比對(duì)分析顯示該氨基酸序列與Rab1a蛋白有較高的同源性，我們將其命名為TvRab1-like。兩氨基酸序列都擁有Rab鳥(niǎo)苷三磷酸酶家族的所有保守結(jié)構(gòu)域、特異性RabF結(jié)構(gòu)域和典型的異戊烯化結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹(shù)分析提示毛滴蟲(chóng)的這兩個(gè)基因系Rab1a的同源基因，在進(jìn)化上它們更接近Rab1亞家族。以基因組DNA為模板擴(kuò)增這兩段序列并與其以cDNA序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因均含有一段25bp的內(nèi)含子。(2)成功構(gòu)建pQE80L／TvRab1a和pQE80L／TvRab1-like原核表達(dá)重組質(zhì)粒，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析顯示，表達(dá)重組質(zhì)粒分別在宿主菌大腸桿菌M15內(nèi)表達(dá)出預(yù)期大小的重組蛋白質(zhì)。(3)經(jīng)Ni-NTA親和柱純化并復(fù)性的兩個(gè)重組蛋白分別免疫豚鼠，，獲得了
[Abstract]:Objective 1) to clone and analyze two homologous genes of Rab1 guanosine triphosphate triphosphatase (Rab1) from Trichomonas vaginalisis, a protozoan trichomonas vaginalis.To construct recombinant plasmids expressing pQE80L/TvRab1a and pQE80L/TvRab1-like prokaryotic expression and express fusion protein.Intracellular localization of Trichomonas vaginalis,Its function is preliminarily determined.Materials and methods two homologous genes of TvRab1 were isolated from the cDNA expression library constructed by Trichomonas vaginalis.The genomic DNA was amplified by PCR and sequenced and sequenced. The two target genes were cloned into prokaryotic expression vector pQE80L and transformed into E. coli E.coli M15 competent cells.Induced by isopropylthio- 尾 -D-galactoside IPTG (isopropylthio- 尾 -D-galactoside), the fusion protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography and purified by SDS-PAGE.The antiserum of recombinant protein was obtained, and the specificity of the antibody was identified by Western blot method. The antibody was used to carry out immunofluorescence cytochemical experiments to localize TvRab1a and TvRab1-like proteins in Trichomonas vaginalis protozoa.Results 1) two Rab1 guanosine triphosphatase homologous genes were found in the constructed cDNA library.One cDNA sequence was 707 base pairs long, and the reading frame contained 606 base pairs. The protein sequence was estimated to contain 202 amino acids.Sequence analysis showed that the amino acid sequence had the highest homology with Rab1a protein subfamily, and it was named TvRab1a.Another cDNA sequence was 717 pairs long, and the reading frame contained 603 pairs of bases, suggesting that the protein sequence had 200 amino acids.Sequence alignment analysis showed that the amino acid sequence had high homology with Rab1a protein, and we named it TvRab1-like.The two amino acid sequences have all conserved domains of Rab guanosine triphosphatase family, specific RabF domain and typical isopentenes domain.The phylogenetic tree analysis indicated that the homologous genes of the two lines of Trichomonas trichomonas Rab1a were closer to the Rab1 subfamily in evolution.Genomic DNA was used as template to amplify the two sequences and compared with their cDNA sequences. It was found that both of the two genes contained an intron of a segment of 25bp. PQE80L/TvRab1a and pQE80L/TvRab1-like prokaryotic expression plasmids were constructed successfully. The results of SDS-PAGE gel electrophoresis showed that the two genes were expressed in E. coli.Two recombinant proteins, which were purified by Ni-NTA affinity column and renatured by Ni-NTA affinity column, were expressed in the host strain E. coli M15, respectively. The recombinant proteins were obtained by immunizing guinea pigs.
【學(xué)位授予單位】：汕頭大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R383

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本文編號(hào)：1748084