發(fā)布時(shí)間：2018-04-13 01:37

  本文選題：乙胺丁醇 + 恥垢分枝桿菌mc~2155　； 參考：《大連醫(yī)科大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 結(jié)核病(tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的傳染性疾病,曾在世界范圍廣泛流行,為嚴(yán)重的全球性健康問(wèn)題之一。近年來(lái),由于多耐藥性(muti-drug resistant, MDR)菌株的出現(xiàn)和HIV(Human Immuno deficiency Virus)的協(xié)同作用,使得結(jié)核病卷土重來(lái),成為當(dāng)今世界三大傳染病之一。因此,開(kāi)發(fā)和研制新一代抗結(jié)核藥物已迫在眉睫,而開(kāi)發(fā)新藥的途徑之一就是利用闡明現(xiàn)有藥物的作用機(jī)制來(lái)篩選和設(shè)計(jì)新藥。 抗結(jié)核的一線藥物之一乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)是抑菌劑,對(duì)細(xì)胞外繁殖期的結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)有抑制作用,且不表現(xiàn)出明顯的耐藥性。一直以來(lái),乙胺丁醇的直接作用靶點(diǎn)被認(rèn)為是合成聚阿拉伯半乳糖的關(guān)鍵酶之一,即阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶(arabinosyl transferase)。對(duì)其可能的作用機(jī)理推斷之一是,乙胺丁醇通過(guò)與阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,抑制了阿拉伯糖基的轉(zhuǎn)移,從而影響了細(xì)胞壁分枝菌酸-聚阿拉伯半乳糖-肽聚糖復(fù)合物的形成,使其它藥物如利福平更易進(jìn)入細(xì)胞而出現(xiàn)協(xié)同抗結(jié)核作用。但是,美國(guó)科羅拉多州立大學(xué)微生物系Mike McNeil教授的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,乙胺丁醇并不直接抑制阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶的活性。并且,在結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)基中加入乙胺丁醇后,細(xì)胞壁中的聚阿拉伯糖在短時(shí)間內(nèi)大量流失,該現(xiàn)象提示乙胺丁醇作用方式與聚阿拉伯糖水解酶的增多有關(guān)。在此基礎(chǔ)上,辛毅首次發(fā)現(xiàn)了M.tuberculosis的模式菌——恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis, M.smegmatis)中一種內(nèi)源性聚阿拉伯糖水解酶的存在。吳雪瓊等人的研究顯示,在69株乙胺丁醇耐藥菌株中約有63.8%的耐藥菌株的阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶embB的結(jié)構(gòu)并沒(méi)有發(fā)生改變,這些結(jié)果提示,乙胺丁醇對(duì)阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶的作用可能并不是直接的。那么,乙胺丁醇的直接作用目標(biāo)是什么?是單一的還是多靶點(diǎn)的?迄今為止,這些問(wèn)題仍懸而未決。 為了揭示乙胺丁醇的作用機(jī)制,本論文試圖利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,分析比較乙胺丁醇處理前后M. smegmatis mc2 155(以下簡(jiǎn)稱mc2 155)菌株蛋白質(zhì)組的變化情況,從蛋白質(zhì)組水平尋找乙胺丁醇特有的作用靶標(biāo),以期發(fā)現(xiàn)更多與乙胺丁醇作用相關(guān)的基因,為闡明這些基因的功能和相互關(guān)系提供前期工作基礎(chǔ)。從應(yīng)用前景來(lái)看,這些工作將為新藥的開(kāi)發(fā)提供有價(jià)值的作用靶點(diǎn),并為新型抗結(jié)核藥物的開(kāi)發(fā)和研制提供線索和依據(jù)。 本課題內(nèi)容包括:1)于600 nm處,分別測(cè)定不同濃度的乙胺丁醇處理前后mc2 155的光吸收值,繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線,確定乙胺丁醇處理的最佳時(shí)間和濃度。以異煙肼、利福平這兩種抗結(jié)核一線藥物為對(duì)比,利用載體兩性電解質(zhì)等電聚焦雙向電泳分析比較乙胺丁醇(EMB)、異煙肼(INH)、利福平(RIF)處理mc2155后的蛋白質(zhì)表達(dá)譜,在蛋白質(zhì)組水平,證實(shí)乙胺丁醇抗結(jié)核作用的獨(dú)特性,為后續(xù)工作奠定基礎(chǔ)并提供依據(jù)。2)收獲最佳藥物處理時(shí)間和濃度的恥垢分枝桿菌mc2 155菌體,超聲破碎法制備可溶性的總蛋白樣品,采用載體兩性電解質(zhì)等電聚焦雙向電泳(carrier ampholytes pH gradient two-dimensional electrophoresis, ISO-2DE)和固相pH梯度熒光差異顯示雙向電泳(fluorescence difference two-dimensional gel electrophoresis, 2D-DIGE)技術(shù),觀察乙胺丁醇處理前后mc2 155細(xì)菌總蛋白的變化情況。利用PDQuest軟件和DeCyder膠內(nèi)差異分析軟件分析乙胺丁醇處理前后mc2 155的總蛋白表達(dá)譜,找到乙胺丁醇處理組特性表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn),進(jìn)一步將乙胺丁醇處理后mc2 155細(xì)菌特異性表達(dá)的總蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶解消化,得到的短肽片段,通過(guò)電噴霧質(zhì)譜(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)進(jìn)行鑒定,將結(jié)果輸入NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配、比對(duì),采用Mascot系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分,推測(cè)可能的蛋白質(zhì)。3)利用去垢劑超速離心法,進(jìn)一步提取乙胺丁醇處理前后mc2 155細(xì)菌的質(zhì)膜蛋白,用載體兩性電解質(zhì)等電聚焦雙向電泳分離mc2 155質(zhì)膜蛋白,利用PDQuest軟件分析找到藥物處理后特異性表達(dá)的膜蛋白質(zhì)斑點(diǎn),將乙胺丁醇處理后mc2 155細(xì)菌特異性表達(dá)的質(zhì)膜蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶解消化,得到的短肽片段,通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF/MS)進(jìn)行鑒定,將結(jié)果輸入NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配、比對(duì),采用Mascot系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)分,推測(cè)可能的蛋白質(zhì)。從亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組水平尋找mc2 155細(xì)菌質(zhì)膜上的乙胺丁醇的作用靶點(diǎn),為進(jìn)一步明確闡述乙胺丁醇的抑菌機(jī)制提供依據(jù)。4)選取表達(dá)差異性顯著的蛋白質(zhì)的氨基酸序列,通過(guò)結(jié)核分枝桿菌GeneBank和恥垢分枝桿菌GeneBank的同源性分析,確定蛋白的基因序列,分別設(shè)計(jì)引物,提取藥物處理前后mc2155的mRNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR),觀察乙胺丁醇處理后mc2 155特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)在mRNA水平的變化情況,以確認(rèn)這些篩選出的基因表達(dá)的陽(yáng)性率。 本研究獲得以下結(jié)果: 1)通過(guò)觀察不同濃度的EMB處理前后恥垢分枝桿菌生長(zhǎng)的變化,發(fā)現(xiàn)各濃度的EMB對(duì)恥垢分枝桿菌生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用。藥物處理3小時(shí),細(xì)菌的增殖開(kāi)始受到明顯的抑制,最佳處理濃度為24.0μg /ml,抑菌率為26.43%。通過(guò)載體兩性電解質(zhì)等電聚焦雙向電泳對(duì)EMB處理組,INH處理組和RIF處理組恥垢分枝桿菌細(xì)胞總蛋白質(zhì)組差異比較時(shí),發(fā)現(xiàn)三者間存在顯著差異。 2)采用載體兩性電解質(zhì)等電聚焦雙向電泳和固相pH梯度熒光差異顯示雙向電泳技術(shù),對(duì)最佳處理濃度和時(shí)間的EMB處理前后的mc2 155可溶性總蛋白質(zhì)進(jìn)行分離,發(fā)現(xiàn)恥垢分枝桿菌細(xì)胞蛋白主要分布在pH 4.0～6.0范圍內(nèi)。利用PDQuest 7.3.1軟件和DeCyder膠內(nèi)差異分析軟件處理,發(fā)現(xiàn)在pI值分布的任一區(qū)域,EMB處理組蛋白斑點(diǎn)數(shù)均少于空白對(duì)照組。對(duì)EMB處理后特異性表達(dá)的40個(gè)可溶性蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這40個(gè)蛋白可大致分為分子伴侶、膜相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄翻譯調(diào)節(jié)因子、酶、其它未知蛋白等五類。在特異性表達(dá)的蛋白中并未發(fā)現(xiàn)阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶(EmbB),提示乙胺丁醇對(duì)EmbB的作用可能并不是直接的。 3)利用去垢劑超速離心法分離純化EMB處理前后mc2 155的質(zhì)膜蛋白,通過(guò)載體兩性電解質(zhì)等電聚焦雙向電泳方法對(duì)純化后的質(zhì)膜蛋白進(jìn)行分離,發(fā)現(xiàn)EMB處理后特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)主要出現(xiàn)在中低分子量區(qū)域,經(jīng)質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析后,確定EMB處理后特異性表達(dá)的5個(gè)疏水性膜蛋白質(zhì)分別為翻譯延長(zhǎng)因子Tu、鉬生物合成協(xié)同因子A、CG30165-PA蛋白、兒茶酚2,3-雙加氧酶、肌球蛋白重鏈樣蛋白。 4)利用RT-PCR方法檢測(cè)特異性表達(dá)蛋白的相關(guān)基因在mRNA水平上的表達(dá)規(guī)律發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組相比,brf和tpx基因在EMB處理組中均呈現(xiàn)較高的表達(dá),而groL基因的表達(dá)則明顯下降。brf、tpx和groL在mRNA水平的表達(dá)情況與蛋白表達(dá)水平相一致。 結(jié)論: 不同濃度的EMB對(duì)恥垢分枝桿菌的增殖均有不同程度的抑制作用。恥垢分枝桿菌細(xì)胞蛋白主要分布在pH 4.0～6.0范圍內(nèi)。在蛋白質(zhì)表達(dá)水平上,空白組和EMB處理組的蛋白確實(shí)存在顯著差異。差異性表達(dá)蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)為研究編碼這些基因的相關(guān)功能和相互關(guān)系提供了研究對(duì)象,該結(jié)果同時(shí)提示,乙胺丁醇對(duì)分枝桿菌增殖的抑制作用可能是多位點(diǎn)、多途徑的過(guò)程。 未來(lái)研究方向: 1.用基因敲除方法進(jìn)一步探討乙胺丁醇處理后mc2 155中特異性表達(dá)的各蛋白質(zhì)與聚阿拉伯糖代謝的相關(guān)性。 2.進(jìn)一步研究這些基因在聚阿拉伯糖代謝中的特定的和確切的功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R52;R378

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1742370