本文選題：乙胺丁醇 + 恥垢分枝桿菌mc~2155　； 參考：《大連醫(yī)科大學》2007年博士論文

【摘要】： 結核病(tuberculosis, TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的傳染性疾病,曾在世界范圍廣泛流行,為嚴重的全球性健康問題之一。近年來,由于多耐藥性(muti-drug resistant, MDR)菌株的出現(xiàn)和HIV(Human Immuno deficiency Virus)的協(xié)同作用,使得結核病卷土重來,成為當今世界三大傳染病之一。因此,開發(fā)和研制新一代抗結核藥物已迫在眉睫,而開發(fā)新藥的途徑之一就是利用闡明現(xiàn)有藥物的作用機制來篩選和設計新藥。 抗結核的一線藥物之一乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)是抑菌劑,對細胞外繁殖期的結核分枝桿菌的生長有抑制作用,且不表現(xiàn)出明顯的耐藥性。一直以來,乙胺丁醇的直接作用靶點被認為是合成聚阿拉伯半乳糖的關鍵酶之一,即阿拉伯糖基轉移酶(arabinosyl transferase)。對其可能的作用機理推斷之一是,乙胺丁醇通過與阿拉伯糖基轉移酶競爭性結合,抑制了阿拉伯糖基的轉移,從而影響了細胞壁分枝菌酸-聚阿拉伯半乳糖-肽聚糖復合物的形成,使其它藥物如利福平更易進入細胞而出現(xiàn)協(xié)同抗結核作用。但是,美國科羅拉多州立大學微生物系Mike McNeil教授的一項實驗結果顯示,乙胺丁醇并不直接抑制阿拉伯糖基轉移酶的活性。并且,在結核分枝桿菌的培養(yǎng)基中加入乙胺丁醇后,細胞壁中的聚阿拉伯糖在短時間內大量流失,該現(xiàn)象提示乙胺丁醇作用方式與聚阿拉伯糖水解酶的增多有關。在此基礎上,辛毅首次發(fā)現(xiàn)了M.tuberculosis的模式菌——恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis, M.smegmatis)中一種內源性聚阿拉伯糖水解酶的存在。吳雪瓊等人的研究顯示,在69株乙胺丁醇耐藥菌株中約有63.8%的耐藥菌株的阿拉伯糖基轉移酶embB的結構并沒有發(fā)生改變,這些結果提示,乙胺丁醇對阿拉伯糖基轉移酶的作用可能并不是直接的。那么,乙胺丁醇的直接作用目標是什么?是單一的還是多靶點的?迄今為止,這些問題仍懸而未決。 為了揭示乙胺丁醇的作用機制,本論文試圖利用蛋白質組學的方法,分析比較乙胺丁醇處理前后M. smegmatis mc2 155(以下簡稱mc2 155)菌株蛋白質組的變化情況,從蛋白質組水平尋找乙胺丁醇特有的作用靶標,以期發(fā)現(xiàn)更多與乙胺丁醇作用相關的基因,為闡明這些基因的功能和相互關系提供前期工作基礎。從應用前景來看,這些工作將為新藥的開發(fā)提供有價值的作用靶點,并為新型抗結核藥物的開發(fā)和研制提供線索和依據。 本課題內容包括:1)于600 nm處,分別測定不同濃度的乙胺丁醇處理前后mc2 155的光吸收值,繪制細菌生長曲線,確定乙胺丁醇處理的最佳時間和濃度。以異煙肼、利福平這兩種抗結核一線藥物為對比,利用載體兩性電解質等電聚焦雙向電泳分析比較乙胺丁醇(EMB)、異煙肼(INH)、利福平(RIF)處理mc2155后的蛋白質表達譜,在蛋白質組水平,證實乙胺丁醇抗結核作用的獨特性,為后續(xù)工作奠定基礎并提供依據。2)收獲最佳藥物處理時間和濃度的恥垢分枝桿菌mc2 155菌體,超聲破碎法制備可溶性的總蛋白樣品,采用載體兩性電解質等電聚焦雙向電泳(carrier ampholytes pH gradient two-dimensional electrophoresis, ISO-2DE)和固相pH梯度熒光差異顯示雙向電泳(fluorescence difference two-dimensional gel electrophoresis, 2D-DIGE)技術,觀察乙胺丁醇處理前后mc2 155細菌總蛋白的變化情況。利用PDQuest軟件和DeCyder膠內差異分析軟件分析乙胺丁醇處理前后mc2 155的總蛋白表達譜,找到乙胺丁醇處理組特性表達的蛋白質斑點,進一步將乙胺丁醇處理后mc2 155細菌特異性表達的總蛋白質斑點進行膠內酶解消化,得到的短肽片段,通過電噴霧質譜(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)進行鑒定,將結果輸入NCBInr數據庫進行匹配、比對,采用Mascot系統(tǒng)進行評分,推測可能的蛋白質。3)利用去垢劑超速離心法,進一步提取乙胺丁醇處理前后mc2 155細菌的質膜蛋白,用載體兩性電解質等電聚焦雙向電泳分離mc2 155質膜蛋白,利用PDQuest軟件分析找到藥物處理后特異性表達的膜蛋白質斑點,將乙胺丁醇處理后mc2 155細菌特異性表達的質膜蛋白質斑點進行膠內酶解消化,得到的短肽片段,通過基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF/MS)進行鑒定,將結果輸入NCBInr數據庫進行匹配、比對,采用Mascot系統(tǒng)進行評分,推測可能的蛋白質。從亞細胞蛋白質組水平尋找mc2 155細菌質膜上的乙胺丁醇的作用靶點,為進一步明確闡述乙胺丁醇的抑菌機制提供依據。4)選取表達差異性顯著的蛋白質的氨基酸序列,通過結核分枝桿菌GeneBank和恥垢分枝桿菌GeneBank的同源性分析,確定蛋白的基因序列,分別設計引物,提取藥物處理前后mc2155的mRNA,進行逆轉錄PCR(RT-PCR),觀察乙胺丁醇處理后mc2 155特異性表達的蛋白質在mRNA水平的變化情況,以確認這些篩選出的基因表達的陽性率。 本研究獲得以下結果: 1)通過觀察不同濃度的EMB處理前后恥垢分枝桿菌生長的變化,發(fā)現(xiàn)各濃度的EMB對恥垢分枝桿菌生長均有不同程度的抑制作用。藥物處理3小時,細菌的增殖開始受到明顯的抑制,最佳處理濃度為24.0μg /ml,抑菌率為26.43%。通過載體兩性電解質等電聚焦雙向電泳對EMB處理組,INH處理組和RIF處理組恥垢分枝桿菌細胞總蛋白質組差異比較時,發(fā)現(xiàn)三者間存在顯著差異。 2)采用載體兩性電解質等電聚焦雙向電泳和固相pH梯度熒光差異顯示雙向電泳技術,對最佳處理濃度和時間的EMB處理前后的mc2 155可溶性總蛋白質進行分離,發(fā)現(xiàn)恥垢分枝桿菌細胞蛋白主要分布在pH 4.0～6.0范圍內。利用PDQuest 7.3.1軟件和DeCyder膠內差異分析軟件處理,發(fā)現(xiàn)在pI值分布的任一區(qū)域,EMB處理組蛋白斑點數均少于空白對照組。對EMB處理后特異性表達的40個可溶性蛋白質斑點進行質譜鑒定和生物信息學分析發(fā)現(xiàn)這40個蛋白可大致分為分子伴侶、膜相關蛋白、轉錄翻譯調節(jié)因子、酶、其它未知蛋白等五類。在特異性表達的蛋白中并未發(fā)現(xiàn)阿拉伯糖基轉移酶(EmbB),提示乙胺丁醇對EmbB的作用可能并不是直接的。 3)利用去垢劑超速離心法分離純化EMB處理前后mc2 155的質膜蛋白,通過載體兩性電解質等電聚焦雙向電泳方法對純化后的質膜蛋白進行分離,發(fā)現(xiàn)EMB處理后特異性表達的蛋白質斑點主要出現(xiàn)在中低分子量區(qū)域,經質譜鑒定和生物信息學分析后,確定EMB處理后特異性表達的5個疏水性膜蛋白質分別為翻譯延長因子Tu、鉬生物合成協(xié)同因子A、CG30165-PA蛋白、兒茶酚2,3-雙加氧酶、肌球蛋白重鏈樣蛋白。 4)利用RT-PCR方法檢測特異性表達蛋白的相關基因在mRNA水平上的表達規(guī)律發(fā)現(xiàn),與空白對照組相比,brf和tpx基因在EMB處理組中均呈現(xiàn)較高的表達,而groL基因的表達則明顯下降。brf、tpx和groL在mRNA水平的表達情況與蛋白表達水平相一致。 結論: 不同濃度的EMB對恥垢分枝桿菌的增殖均有不同程度的抑制作用。恥垢分枝桿菌細胞蛋白主要分布在pH 4.0～6.0范圍內。在蛋白質表達水平上,空白組和EMB處理組的蛋白確實存在顯著差異。差異性表達蛋白質的發(fā)現(xiàn)為研究編碼這些基因的相關功能和相互關系提供了研究對象,該結果同時提示,乙胺丁醇對分枝桿菌增殖的抑制作用可能是多位點、多途徑的過程。 未來研究方向: 1.用基因敲除方法進一步探討乙胺丁醇處理后mc2 155中特異性表達的各蛋白質與聚阿拉伯糖代謝的相關性。 2.進一步研究這些基因在聚阿拉伯糖代謝中的特定的和確切的功能。
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【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R52;R378

【參考文獻】

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本文編號：1742370