發(fā)布時間：2018-04-11 19:34

  本文選題：衰老 + 心肌��； 參考：《山西醫(yī)科大學》2007年碩士論文

【摘要】： 研究背景和目的 衰老是機體隨年齡增加而發(fā)生的所有現(xiàn)象的集中體現(xiàn)。隨著時間的推移,衰老將逐漸導致機體功能障礙,最終導致死亡。因此,可以把衰老定義為機體對內(nèi)、外環(huán)境改變發(fā)生的年齡依賴性的易損性增加,即機體逐漸減弱了對生理刺激的應答能力。衰老的心臟心功能降低,但其機制仍不清楚。大量研究發(fā)現(xiàn),人類和動物衰老過程中出現(xiàn)大量心肌細胞丟失。由于心肌細胞不能再生,衰老心臟的這種細胞丟失很可能是導致其心功能障礙的機制之一,但這一推測需要更多的研究證實。 細胞死亡的主要形式有主動性死亡和被動性死亡。主動性死亡主要包括凋亡,而被動性死亡主要指壞死。由于凋亡是一種基因控制的主動過程,所以抑制凋亡的發(fā)生可能比阻止壞死更容易做到。我們及同行的研究證明,阻斷細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導過程可以明顯改善心功能。生理情況下,凋亡受多種促凋亡分子和抑凋亡分子之間平衡的控制,如果能特異性尋找衰老心臟中激活的促凋亡分子或被破壞的促/抑凋亡分子平衡,并解釋其中失衡機制,可能為特異性防止甚至扭轉(zhuǎn)這種細胞丟失提供新的領域。 活性氧簇(Reactive Oxygen Species,ROS)是已知的衰老過程中蛋白修飾和細胞損傷的重要介質(zhì)。但衰老動物心肌細胞凋亡的增加并不能單一用ROS的產(chǎn)生解釋。近年來大量研究資料表明,源于一氧化氮(Nitric Oxide,NO)的活性氮簇(Reactive Nitrogen Species,RNS)也是蛋白修飾和細胞損傷的重要介質(zhì)。NO由三種一氧化氮合酶(Endothelial NitricOxide Synthase,eNOS;Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS;Neuronal Nitric Oxide Synthase,nNOS)催化L-精氨酸生成。 大量研究表明RNS具有抗凋亡和抑凋亡的雙重作用,濃度、胞內(nèi)時空分布、氧化還原狀態(tài)可能是RNS促進或抑制細胞凋亡的決定因素。生理狀態(tài)的NO(低濃度的NO)可直接與O_2生成NO_2,后者再與另一NO反應生成N_2O_3,N_2O_3可作為NO~+供體,使蛋白質(zhì)發(fā)生S-亞硝基化,后者是NO抗凋亡效應的主要途徑;而高濃度的NO(如iNOS催化生成的NO)可以與O_2~-反應生成極為活躍的過氧亞硝基(ONOO),,它可以作為NO_2~+的供體導致蛋白質(zhì)的硝基化,后者是NO致凋亡效應的主要途徑。細胞培養(yǎng)研究證明,衰老的內(nèi)皮細胞中S-亞硝基化蛋白質(zhì)含量下降,但衰老心臟心肌細胞的S-亞硝基化蛋白質(zhì)含量是否下降,以及衰老的心肌細胞凋亡增高的原因是否與其RNS的促凋亡和抑凋亡效應失調(diào)有關還未確定。 NO不能直接引起蛋白質(zhì)S-亞硝基化,必需通過NO~+供體(N_2O_3)或NO丟失一個電子產(chǎn)生NO~+來參與這一過程。由于N_2O_3的生成需要2分子的NO,在細胞膜中脂溶性的NO與O_2更易聚集而生成NO~+供體---N_2O_3,從而使蛋白質(zhì)更易發(fā)生S-亞硝基化。由于eNOS是唯一與膜相關的NOS,其含量和活性很可能與蛋白質(zhì)S-亞硝基化密切相關。有研究資料表明,衰老動物及培養(yǎng)的衰老細胞中eNOS的含量和活性下降,但老年大鼠心肌組織中的eNOS表達變化報道不一;此外,eNOS表達水平是否與S-亞硝基化蛋白質(zhì)含量相關還不清楚。 方法 (1)分別選取雄性成年(4-6月,n=10)和老年(22-24月,n=16)SD大鼠,設立成年大鼠組與衰老大鼠組,經(jīng)右側(cè)頸總動脈插管進入左心室,監(jiān)測心率、左心室壓力、左心室壓力變化最大速率和心肌收縮指數(shù)(Cardiac Index,CI)等心功能指標; (2)分別采用原位末端標記法(Terminal deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP NickEnd Labeling,TUNEL)和caspase-3活性測定法檢測心肌組織中細胞凋亡發(fā)生情況; (3)采用免疫組化方法檢測心肌組織中的S-亞硝基化的蛋白質(zhì)和內(nèi)皮型-氧化氮合酶(eNOS)的分布及含量; (4)利用NitroGlo試劑盒(PerkinElmer)檢測心肌組織中S-亞硝基化的蛋白質(zhì)表達水平; (5)用Western-blot法檢測心肌組織中eNOS和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達; (6)硝基酪氨酸(Nitrotyrosine,NT)是體內(nèi)生成過氧亞硝基(ONOO~-)的標志物,用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)檢測NT的表達。 結(jié)果 1.衰老大鼠心功能明顯降低 1.1心肌收縮功能的指標 CI為反映心臟收縮功能的指標之一,與成年大鼠(CI:46.82±3.176 s~(-1))相比,衰老大鼠的相應指標(CI:39.23±1.62 s~(-1),P＜0.05)明顯下降; 1.2心肌舒張功能的指標 與成年大鼠反映舒張能力的心功能指標左室舒張壓(LeR Ventricular DiastolicPressure,LVDP:-1.16士0.35kPa)和左室舒張末壓(Left Ventricular End-DiastolicPressure,LVEDP:-0.70±0.43 kPa)相比,衰老大鼠的相應各項心功能指標(LVDP:0.16士0.17kPa,P＜0.01;LVEDP:1.25±0.35kPa,P＜0.01)明顯增高。 以上結(jié)果提示衰老大鼠的心肌收縮及舒張功能均明顯低于成年大鼠。 2.衰老大鼠的心臟相對質(zhì)量明顯降低 稱量成年大鼠(n=8)和衰老大鼠(n=26)的心重及體重并計算其心重/體重比。與成年大鼠心重(0.6l±0.04g)相比,衰老大鼠的心重(1.42±0.04g,P＜0.01)顯著增加,但與成年大鼠的心重/體重比(0.31%士0.01%)相比,衰老大鼠的心重/體重比(0.26%4±0.01%,P＜0.01)卻顯著下降; 3.衰老大鼠心肌細胞凋亡增加 3.1 TUNEL染色結(jié)果 TUNEL染色是檢測細胞凋亡的一種較靈敏的方法,通過該方法分別對成年大鼠及衰老大鼠心肌組織進行檢測、并計數(shù)凋亡指數(shù),結(jié)果顯示,成年大鼠心肌細胞凋亡率為0.86%±0.29%,衰老大鼠達到2.86%±0.43%,二者相比,衰老大鼠心肌細胞凋亡明顯增加(P＜0.05): 3.2 Caspase-3活性測定結(jié)果 Caspase-3是細胞凋亡最后通路的關鍵蛋白,其活性可以定量反映細胞凋亡發(fā)生情況。通過對大鼠心肌組織Caspase-3活性測定的結(jié)果表明,與成年大鼠的caspase-3比活性(1.00±0.028)相比,衰老大鼠的caspase-3的比活性(2.21±0.327,P＜0.01)顯著增高: 3.3衰老大鼠心肌細胞凋亡與心功能的相關性分析 3.1.1 Caspase-3活性與心肌收縮功能指標CI呈負相關 大鼠心肌組織caspase-3活性與CI呈負相關(r=-0.772,P＜0.01),,即隨著caspase-3活性增高,CI降低.或者說,caspase-3活性越高,大鼠心肌收縮功能越差。我們的結(jié)果提示:老年大鼠心肌收縮功能下降可能與其凋亡水平增加有關。 3.1.2 Caspase-3活性與心肌舒張功能指標LVDP呈正相關大鼠心肌組織caspase-3活性與LVDP呈正相關(r=0.718,P＜0.01),即隨著caspase-3活性增高,LVDP相應增加,即caspase-3活性越,心肌舒張功能越差。提示:與成年大鼠相比,老年大鼠心肌舒張功能下降可能與其凋亡水平增加有關。 4.1衰老大鼠心肌組織硝基酪氨酸含量升高 本實驗通過雙抗體夾心ELISA法檢測成年大鼠和衰老大鼠心肌組織的NT的表達含量。結(jié)果表明,與成年大鼠的NT(0.858±0.143 ng/ml)相比,衰老大鼠的NT(1.545±0.194 ng/ml,P＜0.05)明顯升高,說明衰老大鼠心肌組織中有大量過氧亞硝基產(chǎn)生: 4.2心肌組織硝基酪氨酸含量與caspase-3活性呈正相關 大鼠心肌組織硝基酪氨酸含量與caspase-3活性呈正相關(r=-0.770,P＜0.01),即隨著硝基酪氨酸含量增高,caspase-3活性相應增加�；蛘哒f,心肌組織中硝基酪氨酸含量越高,心肌細胞凋亡水平越高。這一結(jié)果提示我們:老年大鼠心肌組織凋亡水平增加可能與其硝基酪氨酸含量增高有關。 4.3衰老大鼠心肌組織S-亞硝基化的蛋白質(zhì)表達降低 采用免疫組化法和NitroGlo試劑盒(PerkinElmer)檢測成年大鼠(n=6)和衰老大鼠(n=6)心肌組織中S-亞硝基化的蛋白質(zhì)的分布及表達。與成年大鼠(41208±492)相比,衰老大鼠心肌組織中S-亞硝基化的蛋白質(zhì)(36472±1239,P＜0.01)顯著下降; 4.4心肌組織中S-亞硝基化的蛋白質(zhì)與caspase-3活性呈負相關 大鼠心肌組織的S-亞硝基化蛋白質(zhì)含量與caspase-3活性呈負相關(r=-0.767,P＜0.01),即隨著S-亞硝基化的蛋白質(zhì)含量降低,caspase-3活性增加�；蛘哒f,心肌組織中S-亞硝基化的蛋白質(zhì)含量越低,心肌細胞凋亡水平越高。提示:老年大鼠心肌組織凋亡水平增加可能與其S-亞硝基化蛋白質(zhì)的含量降低有關。 5.衰老大鼠心肌組織iNOS表達增高,eNOS表達降低 5.1衰老大鼠心肌組織iNOS表達升高 用Western-blot檢測成年大鼠和衰老大鼠心肌組織中iNOS表達水平。與成年大鼠的iNOS(125610±11765)相比,衰老大鼠的心肌組織的iNOS(235485±46070,P＜0.01)顯著升高; 5.2心肌組織中iNOS表達與硝基酪氨酸含量呈正相關 大鼠心肌組織中iNOS表達與硝基酪氨酸含量呈正相關(r=0.600,P＜0.05),即隨著iNOS表達增高,NT相應增加。也可以說,心肌組織中iNOS表達越高,硝基酪氨酸含量越高。提示:老年大鼠心肌組織中硝基酪氨酸含量增高可能與其iNOS表達增加有關。 5.3衰老大鼠心肌組織中eNOS表達降低 用免疫組化法和Western-blot法檢測成年大鼠和衰老大鼠心肌組織中eNOS分布及表達。與成年大鼠(564.1±52.9)相比,衰老大鼠心肌組織中eNOS表達(268.4±57.5,P＜0.05)明顯下降。 5.4心肌組織中eNOS表達與S-亞硝基化的蛋白質(zhì)含量呈正相關 大鼠心肌組織中eNOS表達與S-亞硝基化蛋白質(zhì)含量呈正相關(r=0.622,P＜0.05),即隨著eNOS表達下降,S-亞硝基化的蛋白質(zhì)含量相應降低�；蛘哒f,心肌組織中eNOS表達越低,S-亞硝基化蛋白質(zhì)的含量越低。提示:老年大鼠心肌組織中S-亞硝基化的蛋白質(zhì)含量降低可能與其eNOS表達下降有關。 結(jié)論 1.衰老大鼠心肌細胞凋亡增加、心臟相對質(zhì)量下降、心功能明顯降低; 2.衰老大鼠心肌組織中,具有細胞毒性的ONOO大量生成,而保護心肌細胞的S-亞硝基化的蛋白質(zhì)含量下降,減弱其對心肌細胞凋亡的抑制作用。因此,衰老大鼠心肌組織中促凋亡和抑凋亡RNS的失衡,有可能通過促進心肌細胞凋亡導致心肌細胞丟失,最終造成心臟收縮和舒張功能的下降。 3.與成年大鼠相比,衰老大鼠心肌組織中iNOS表達明顯增高;同時,eNOS表達明顯下降。產(chǎn)生RNS的酶NOS,在衰老大鼠心肌組織中的表達失調(diào),很可能是導致其RNS失調(diào)的原因之一。 4.上述結(jié)果提示,產(chǎn)生RNS的酶的種類、RNS中的有毒產(chǎn)物和RNS的化學修飾等環(huán)節(jié)在心肌組織衰老過程中起重要作用。如果在臨床工作中采取降低iNOS活性、增加eNOS活性、清除ONOO~-或者補充S-亞硝基化蛋白質(zhì)等干預措施,可能將有助于減輕心肌組織的老化。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R361

【共引文獻】

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1 林偉;菠蘿蛋白酶預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[D];福建醫(yī)科大學;2010年

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本文編號：1737375