本文選題：大鼠DC　切入點(diǎn)：RNAi干涉　出處：《吉林大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 目的:探討RNAi (RNA interference)技術(shù)沉默樹突狀細(xì)胞CD40基因,建立DC(Dentritic cells)細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法,對體外脾淋巴細(xì)胞的影響,對IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10分泌的影響,為尋求治療急性移植排斥反應(yīng)提供基礎(chǔ)研究。 方法: 1.DC細(xì)胞培養(yǎng): 培養(yǎng)參照Giannoukakis等報(bào)道的方法[Molecular Therapy 2000;1(5):430-437]。從Dark Agouti (DA)供體大鼠股骨中獲取的骨髓細(xì)胞在含2ml RPMI-1640的24孔培養(yǎng)板(2×106/孔)中培養(yǎng),其中含抗生素10%(v/v)小牛血清FCS。加入基因重組大鼠GM-CSF(20ng/mL)以擴(kuò)增未成熟DC。除GM-CSF外,加入基因重組大鼠IL-4 (20 ng/mL)以獲得成熟DC。在選定的培養(yǎng)孔,于培養(yǎng)開始時(shí)分別加入pSilencer1:U6-CD40 siRNA和pSilencer空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,以鑒定siRNA-CD40抑制由IL-4誘導(dǎo)的DC成熟的能力和其抑制DC中CD40基因表達(dá)的能力。每2天更換富含細(xì)胞因子的培養(yǎng)液;輕微旋動培養(yǎng)板后,吸除一半舊培養(yǎng)液,再加入等量且含細(xì)胞因子的新鮮培養(yǎng)液。因此,非貼壁的粒細(xì)胞將被清除又可確保那些已生長出的松散地附在彈性帖壁巨嗜細(xì)胞單層上的DC細(xì)胞簇不被同時(shí)移除。10天后收集那些自動從DC細(xì)胞簇離開的未帖壁DC。 2.大鼠Silencer2.1-U6- siRNA-CD40重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 (1)siRNA靶位點(diǎn)的選擇及編碼siRNA DNA模板的體外合成根據(jù)GeneBank(AF241231)大鼠CD40基因mRNA的已知序列,尋找符合特征的靶序列,合成分別針對其三個(gè)編碼區(qū)合成兩條DNA寡核苷酸鏈(分別命名為CD40 -1,-2,-3)并用RNA structure 4.11軟件對其二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,每條模板鏈的組成包括19個(gè)堿基正義鏈和與其互補(bǔ)的19個(gè)堿基的反義鏈,正反鏈之間有9個(gè)堿基(TTCAAGAGA)間隔,反義鏈之后有5個(gè)T作為轉(zhuǎn)錄終止信號,在模板鏈的兩端加入Hind III及BamH I酶切位點(diǎn)。合成兩條鏈在退火緩沖液(100mM K-acetate, 30mM HEPES-KOH pH 7.4, 2 mMMg-acetate)作用下退火(90℃,3min,37℃,1hr),形成雙鏈結(jié)構(gòu)。待連接。 (2)pSilencer2.1-U6載體線性化及回收 pSilencer?2.1-U6 neo質(zhì)粒:全長4521bp,含有U6啟動子,氨芐抗性,含NEO基因,可由新霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。pEGFP質(zhì)粒:帶有增強(qiáng)綠色熒光蛋白的原核克隆和表達(dá)載體,全長3.4kb,含有LacZ啟動子,氨芐抗性;同時(shí)與Silencer2.1-U6-siRNA重組共轉(zhuǎn)染,估計(jì)細(xì)胞體系的轉(zhuǎn)染效率。將pSilencer2.1-U6用BamH I及Hind III分別消化,對消化后產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,將含有線性化質(zhì)粒的凝膠在紫外燈下切下,放入1.5ml離心管中,加入3倍體積的融膠液,45℃-55℃水浴5-10min,使膠完全融化,加入10μl玻璃奶(通常1μgDNA用1μl玻璃奶),混勻,45℃-55℃冰水浴5-10min,其間每隔2-3min混勻一次,5,000轉(zhuǎn)/min離心30-60s,棄上清,加入400μl洗液,輕彈管底,5,000轉(zhuǎn)/min離心30s,棄上清,重復(fù)上述步驟一次,吸凈洗液,室溫干燥,加入10-30μl無菌雙蒸水,將玻璃奶懸起,45℃-55℃水浴5-10min,10,000轉(zhuǎn)/min離心1-2min,回收上清用λDNA mark做標(biāo)準(zhǔn)品定量,待連接。 (3)載體與siRNA模板鏈連接 連接體系中模板與載體的摩爾數(shù)比約為3-5:1,充分混勻,加入T4連接酶16℃反應(yīng)過夜。連接產(chǎn)物可立即轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞或于-20℃保存。同時(shí)進(jìn)行空載體自身環(huán)化作為陰性對照。 (4)感受態(tài)細(xì)胞的制備與連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 取-70℃保存的GM109大腸桿菌接種于平板,次日挑取單菌落接種于LB固體培養(yǎng)基中,370C培養(yǎng)過夜。用無菌簽挑取單菌落,轉(zhuǎn)到3mlLB液體培養(yǎng)基中,37℃300rpm振蕩2h,取1ml菌液接種到100ml LB培養(yǎng)基中,37℃繼續(xù)培養(yǎng)待OD600大約為0.4時(shí)取出,冰浴10min。將菌液轉(zhuǎn)到滅菌的預(yù)冷50ml離心管中,4℃4000g離心10min回收細(xì)菌,重懸于10mlCaCl2(0.1mol/L)中,冰浴30min , 4℃4000離心10min ,棄上清,加4 ml預(yù)冷的CaCl2(0.1mol/L),置于4℃,16h后用于轉(zhuǎn)化試驗(yàn),或加入甘油至終濃度10%,-70℃保存?zhèn)溆�。�?00μl的感受態(tài)細(xì)菌,加入5μl pSilencer2.1-U6與siRNA連接產(chǎn)物,用空載體作對照,輕輕旋轉(zhuǎn)混勻,冰浴30min,42℃熱休克90s,快速放置冰浴中2min,加入800μl LB培養(yǎng)基(不含Amp),37℃振蕩培養(yǎng)60min,吸100μl培養(yǎng)液滴于含Amp的LB平板涂勻,待表面液體吸收后,倒置平皿37℃培養(yǎng)16-20h。 (5)陽性重組克隆的篩選(堿裂解法) 15,000rpm離心10min,棄上清,加入冰冷的75%乙醇洗一次,離心室溫干燥,用含RNase(50μg/ml)的雙蒸水10μl充分溶解沉淀。用M13F(-40): 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3' Rev: 5'-GAGTTAGCTCACTCATTAGGC-3' primer測序。 (6)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染 DC細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基加10%小牛血清37℃,5% CO2培養(yǎng)。用100 ml培養(yǎng)瓶,當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)到80%-90%融合,用無血清培養(yǎng)基洗三遍,將脂質(zhì)體15μl加無菌水85μl室溫放置10分鐘,重組質(zhì)粒18μg用無菌水加至總體積100μl室溫放置10分鐘,兩者混合室溫放置10分鐘后加入細(xì)胞無血清培養(yǎng)液中,用pEGFP質(zhì)粒與psilencer1.0-U6-CD40-siRNA按1:20的比例以慢病毒為載體共轉(zhuǎn)染,以標(biāo)記陽性轉(zhuǎn)染的細(xì)胞;空質(zhì)粒對照用psilencer1.0-U6質(zhì)粒,另外一組只用脂質(zhì)體加入培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi);于轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí),加G418(新霉素)進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染陽性克隆篩選,篩選21天后收集細(xì)胞,做Western blot分析。 3.Western blot測定RNAi干涉后CD40基因在DC中的表達(dá)情況裂解RNAi干涉后的DC,用常規(guī)Western blot方法檢測CD40表達(dá)情況。 4.單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR) 采用3HTdR摻入法。刺激物為RNAi干涉后的DC;反應(yīng)物為Lewis大鼠的脾細(xì)胞。最后用自動液閃計(jì)數(shù)儀測定每分鐘脈沖數(shù)值。 5.通過ELISA的方法檢測大鼠淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的情況。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS軟件包(10.0版)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,多組資料均數(shù)比較采用F檢驗(yàn),若差異有顯著性,則進(jìn)一步進(jìn)行q檢驗(yàn)。 結(jié)果: 1.成功從大鼠骨髓細(xì)胞中體外誘導(dǎo)培養(yǎng)出樹突狀細(xì)胞。 2.通過感染含有RNAi序列的慢病毒可以抑制樹突狀細(xì)胞中CD40的表達(dá)。 3.RNAi沉默后樹突狀細(xì)胞體外活化脾細(xì)胞的能力減弱。 4.RNAi干涉后的DC活化的淋巴細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ的量顯著減少 結(jié)論: 應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默DC上的CD40,切斷第二信號傳遞使T細(xì)胞沉默,不被激活,達(dá)到抑制急性免疫排斥反應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R392.4

【參考文獻(xiàn)】

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10 陳楠;;樹突狀細(xì)胞：腎臟疾病干預(yù)調(diào)節(jié)的新靶標(biāo)[J];中華腎臟病雜志;2006年10期

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本文編號：1728175