本文選題：丙型肝炎病毒　切入點(diǎn)：F蛋白　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： HCV屬于黃病毒家族,基因組為單正鏈RNA,全長(zhǎng)約9.6kb,由5’非翻譯區(qū)、一個(gè)開放閱讀框(open reading frame,ORF)、3’非翻譯區(qū)組成。ORF包含10個(gè)基因,編碼一條由3010~3030個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白前體肽鏈,在宿主細(xì)胞和病毒蛋白酶的加工下,產(chǎn)生至少10種成熟的HCV蛋白質(zhì),分別是C(core)、E1(envelope 1)、E2、p7、NS2(nonstructural protein 2)、NS3、NS4A、NS4B、NS5A以及NS5B蛋白。近年來發(fā)現(xiàn),C基因區(qū)存在一個(gè)重疊的替代讀碼框(alternate reading frame,ARF),編碼一種新的HCV病毒蛋白質(zhì),命名為F蛋白。F蛋白主要分布在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,半衰期為5~10min,功能尚不清楚。為此,本研究開展了F蛋白原核表達(dá)、純化以及抗原性,F蛋白與細(xì)胞凋亡的關(guān)系和F蛋白磷酸化對(duì)其細(xì)胞內(nèi)分布影響共3方面研究工作,旨在考察F蛋白與HCV致病性的關(guān)系,為HCV預(yù)防與治療提供新的理論依據(jù)。 一、HCV F蛋白表達(dá)、純化以及抗原性 首先,我們根據(jù)大腸桿菌密碼子偏嗜性原則設(shè)計(jì)了11條引物,應(yīng)用引物延伸法合成了HCV f基因,以此為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增得到截短型f65基因片段(219bp)。將f65基因片段定向克隆至pET32a(+),得到pET32a-f65重組子,然后將重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌Plyss菌株,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得分子量約32kDa的HCV F65蛋白。F65蛋白主要以可溶性形式存在于細(xì)菌裂解液上清中。0.6mM和1mM IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生的可溶性F65蛋白分別為菌體蛋白的33.4%和34.2%。我們采用Ni-NTA樹脂純化可溶性F65蛋白,SDS-PAGE電泳顯示不含雜蛋白條帶,F65蛋白濃度為38~72μg/ml。WB(Western blotting)證實(shí),純化的F65蛋白能與His單抗發(fā)生結(jié)合反應(yīng),但不與GFP單抗發(fā)生結(jié)合反應(yīng),說明F65蛋白抗原特異性強(qiáng)。其次,我們以50μg/mL高純度F65蛋白為包被抗原,采用ELISA法分別檢測(cè)了正常人、HBV感染者以及HCV感染者(n=30)血清中F抗體。30份正常人血清、乙肝患者血清以及丙肝患者血清平均A450分別為0.044±0.011,0.054±0.023和0.125±0.061,丙肝組與乙肝組差異顯著(p㩳0.001)。以正常人血清平均A450值為陰性對(duì)照值,根據(jù)公式臨界值=2.1×陰性對(duì)照A450,計(jì)算得到臨界值為0.092。以0.092為臨界值,19份丙肝患者血清F抗體陽性,陽性率為63.3%(19/30);1份乙肝患者血清F抗體陽性,陽性率為3.3%(1/30),可能為HCV混合感染;丙肝患者血清F抗體陽性率顯著高于乙肝患者血清(p㩳0.001)。最后,我們應(yīng)用F65蛋白免疫新西蘭家兔制備多克隆F抗體,再用SPA樹脂純化兔血清中F抗體,獲得了純化的兔源性F多抗。WB證實(shí),F多抗能與HCV F65蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng),效價(jià)為1:30000;但是F多抗與pET32a(+)載體自身蛋白(Trx蛋白)不發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。本節(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HCV F65蛋白具有特異的抗原性,可用來檢測(cè)血清中F抗體;HCV感染者血清中存在F抗體;兔源性F抗體可用來檢測(cè)HCV F蛋白。 二、HCV f基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞增殖及抗TNF-α誘導(dǎo)的凋亡 我們應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將F蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1+-f轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞,應(yīng)用350μg/ml G418篩選得到穩(wěn)定表達(dá)F蛋白的HepG2細(xì)胞(Hep-f),以轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1+的HepG2細(xì)胞(Hep-3.1)為對(duì)照。WB檢測(cè)顯示,第1代和第10代Hep-f細(xì)胞均能表達(dá)14kDa左右的F蛋白。其次,我們應(yīng)用MTT法分別測(cè)定Hep-f和Hep-3.1細(xì)胞生長(zhǎng)情況,結(jié)果顯示Hep-3.1細(xì)胞生長(zhǎng)速度落后于Hep-f細(xì)胞生長(zhǎng)速度(p㩳0.01),說明HCV f基因促進(jìn)HepG2細(xì)胞增殖。分別采用20、40、60、100和200IU/ml TNF-α處理Hep-f和Hep-3.1細(xì)胞,然后應(yīng)用MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)情況,結(jié)果表明,20~200IU/ml TNF-α對(duì)Hep-f和Hep-3.1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率分別為4.8~19.4%和8.3~53.1%,前者低于后者(p㩳0.05),提示Hep-f細(xì)胞對(duì)TNF-α具有一定的抵抗作用。 接著,我們應(yīng)用100IU/ml TNF-α分別處理Hep-f和Hep-3.1細(xì)胞,再應(yīng)用Annexinⅴ/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定TNF-α處理18h和36h的細(xì)胞凋亡率,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn),凋亡率以X±SD來表示,結(jié)果為:TNF-α作用18h后,Hep-f和Hep-3.1細(xì)胞凋亡率分別為(0.41±0.11)%和(37.43±2.03)%,兩者差異顯著(p㩳0.001);TNF-α作用36h后,Hep-f和Hep-3.1細(xì)胞凋亡率分別為(10.03±0.41)%和(44.63±3.37)%,兩者差異顯著(p㩳0.001)。同時(shí),我們采用Hochest33342標(biāo)記后激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)改變,結(jié)果顯示:100IU/ml TNF-α作用18h后,Hep-3.1細(xì)胞胞核發(fā)生固縮、脫落形成凋亡小體等異常改變,Hep-f細(xì)胞胞核也出現(xiàn)以上異常改變,但是Hep-3.1細(xì)胞胞核發(fā)生異常改變的比例高于Hep-f細(xì)胞。以上兩方面的結(jié)果提示,Hep-f細(xì)胞可以抵抗TNF-α誘導(dǎo)的凋亡作用。 最后,為了探討Hep-f細(xì)胞抗凋亡表型與NF-κB活化的關(guān)系,我們應(yīng)用100IU/ml TNF-α處理Hep-f和Hep-3.1細(xì)胞,然后分別于0h、0.5h、1h、2h、18h、36h檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NF-κB-p65和IκB-α表達(dá)量,結(jié)果顯示:(1)Hep-f細(xì)胞內(nèi)p65總量在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)依次為2.85,2.67,2.61,2.84,2.80,2.69,對(duì)照的Hep-3.1細(xì)胞則為2.88,2.94,2.86,2.76,2.71,2.50,兩種細(xì)胞內(nèi)的p65總量無顯著差別(p㧐0.05);(2)Hep-f細(xì)胞核內(nèi)p65含量在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)依次為1.10,3.90,3.92,3.92,2.07,1.67,對(duì)照的Hep-3.1細(xì)胞則為1.08,2.05,2.04,1.95,1.03,1.10,兩種細(xì)胞核內(nèi)的p65含量有顯著差別(p㩳0.05),并且,Hep-f細(xì)胞核內(nèi)p65含量變化規(guī)律不同于Hep-3.1細(xì)胞;Hep-f細(xì)胞核內(nèi)p65變化分為3個(gè)階段: p65急劇上升到處理前水平的3~4倍(0~0.5h期間),p65維持在處理前3~4倍的高峰水平(0.5~2h期間),p65緩慢減少但始終高于處理前水平(2~36h期間);Hep-3.1細(xì)胞核內(nèi)p65變化分為4個(gè)階段: p65急劇上升到處理前水平的1~2倍(0~0.5h期間),p65維持在處理前水平的1~2倍水平(0.5~2h期間),p65含量持續(xù)下降至18小時(shí)后恢復(fù)到處理前水平(2~18h期間),p65維持在處理前水平(18~36h期間)。以上結(jié)果提示,Hep-f細(xì)胞內(nèi)NF-κB異�；罨�,活化強(qiáng)度過高,活化持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)。(3)Hep-f細(xì)胞質(zhì)內(nèi)IκBα含量在6個(gè)時(shí)間點(diǎn)依次為0.46,0.37,0.19,0.25,0.32,0.34,對(duì)照的Hep-3.1細(xì)胞則為0.45,0.39,0.31,0.39,0.5,0.52,兩種細(xì)胞質(zhì)內(nèi)IκBα含量有顯著差別(p㩳0.05)。TNF-α處理的Hep-f細(xì)胞,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)IκBα含量在0~1h內(nèi)減少,之后的1~36h內(nèi)緩慢增加,但始終低于TNF-α處理前水平。TNF-α處理的Hep-3.1細(xì)胞,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)IκBα在0~1h內(nèi)減少,之后的1~2h內(nèi)緩慢增加,至2h已經(jīng)接近TNF-α處理前水平,2h~36h內(nèi)逐漸恢復(fù)到處理前水平。我們的結(jié)論是,HCV F蛋白引起細(xì)胞內(nèi)NF-κB異�；罨�,使得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染f基因的HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出抗凋亡表型。 三、HCV F蛋白磷酸化位點(diǎn)突變與細(xì)胞內(nèi)分布關(guān)系 我們應(yīng)用NetPhos2.0 Server軟件預(yù)測(cè)F蛋白的磷酸化位點(diǎn),據(jù)此設(shè)計(jì)重疊引物,應(yīng)用引物延伸法獲得突變型HCV f基因,該基因第13、14、114、121和124位密碼子由野生型f基因的TCT突變?yōu)镚AT,對(duì)應(yīng)氨基酸由絲氨酸(S)突變?yōu)樘於彼?D)。將突變型f基因及野生型f基因定向克隆至pEGFP-N1,得到pEGFP-mf和pEGFP-f重組子。采用脂質(zhì)體法將重組子轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,再用激光共聚焦顯微鏡觀察突變型F蛋白以及野生型F蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布情況,拍照并進(jìn)行半定量分析。結(jié)果顯示,在HepG2細(xì)胞中,突變型F蛋白主要分布在細(xì)胞核內(nèi)(90%),細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有少量分布(10%),平均熒光強(qiáng)度分別為63.70±3.20和7.06±0.34,統(tǒng)計(jì)學(xué)上兩者差異顯著(p0.001);野生型F蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(94.9%),細(xì)胞核內(nèi)有少量分布(5.1%),平均熒光強(qiáng)度分別為83.34±4.07和4.48±0.22,統(tǒng)計(jì)學(xué)上兩者差異顯著(p0.001)。以上結(jié)果提示,HCV F蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在磷酸化和非磷酸化2種形式,其功能也不同。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以磷酸化F蛋白為主,非磷酸化F蛋白主要位于細(xì)胞核內(nèi)。磷酸化F蛋白可能參與HCV病毒復(fù)制調(diào)節(jié),非磷酸化F蛋白可能影響細(xì)胞核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R373

【參考文獻(xiàn)】

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1 邵圣文;武文斌;于建國;趙平;戚中田;;丙型肝炎病毒F蛋白抗原性及患者血清F抗體流行率的研究[J];中華肝臟病雜志;2006年12期

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本文編號(hào)：1723522