本文選題：Ser-125突變型人白細胞介素-2　切入點：β-乳球蛋白　出處：《南京師范大學》2005年碩士論文

【摘要】：人白細胞介素-2(HuIL-2)主要是由激活的T淋巴細胞產(chǎn)生的一種淋巴因子,在機體免疫應答中起重要作用,能誘導T淋巴細胞增殖(從G_0期到S期)和分化,并且具有刺激T輔助細胞和自然殺傷細胞分泌細胞因子等功能,因而具有廣泛的生物學活性,在臨床上具有抗腫瘤、抗感染及增強機體免疫功能等作用。天然IL-2由133個氨基酸殘基組成,在58、105和125位各有一個半胱氨酸(Cys),其中58位和105位形成二硫鍵是IL-2生物活性所必需,125位半胱氨酸的存在易形成錯配或二聚體,使IL-2活性喪失,因此將125位半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸可以消除形成錯配或二聚體的分子基礎,便于純化。 動物乳腺生物反應器以其生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高且表達產(chǎn)物接近天然產(chǎn)物而日益受到人們重視。但建立乳腺生物反應器是一項周期長、耗資大的工作,而且外源基因的隨機表達也給這項工作帶來很大麻煩,因此在建立大型轉(zhuǎn)基因動物個體之前,先用小動物鑒定所構(gòu)建載體的可行性十分必要。 本研究用PCR定點突變法將天然人白細胞介素-2的125位半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸,得到Ser-125突變型人白細胞介素-2(Ser-125 HuIL-2)cDNA,并從山羊新鮮血液中擴增到867bp的β-乳球蛋白(BLG)基因的上游調(diào)控序列,然后將Ser-125突變型人白細胞介素-2 cDNA與山羊β-乳球蛋白(BLG)基因的上游調(diào)控序列融合,構(gòu)建了pBLG—Ser-125HuIL-2乳腺定位表達載體。表達載體經(jīng)純化后用脂質(zhì)體包裹,經(jīng)乳腺導管注入妊娠后期的家兔和山羊乳腺內(nèi),進行瞬時表達。分別于家兔和山羊分娩后1～10d采奶,用ELISA方法檢測乳汁中Ser-125HuIL-2含量。家兔共做了6只,其中1只作為空白對照,1只注射脂質(zhì)體包裹的pIL-2質(zhì)粒,2只注射表達載體,2只注射脂質(zhì)體包裹的表達載體,結(jié)果注射空白對照和pIL-2質(zhì)粒的2只家兔均未表達;2只直接注射表達載體的家兔1只有表達,含量為0.06～0.53μg/L,1只未表達,表達成功率50%(1/2);
[Abstract]:Human interleukin-2 (hIL-2) is a kind of lymphoid factor produced mainly by activated T lymphocytes. It plays an important role in the immune response of the body and can induce the proliferation and differentiation of T lymphocytes (from G0 to S).It has the function of stimulating T helper cells and natural killer cells to secrete cytokines, so it has a wide range of biological activities, and has anti-tumor, anti-infection and enhance the immune function of the body.Natural IL-2 is composed of 133 amino acid residues, and there is a cysteine cysteine in 58105 and 125.The disulfide bond at 58 and 105 is necessary for the biological activity of IL-2. The existence of cysteine at 125th is easy to form mismatch or dimer, which results in the loss of IL-2 activity.Therefore, mutagenesis of 125 cysteine to serine can eliminate the molecular basis of mismatch or dimer and facilitate purification.Animal mammary gland bioreactor has been paid more and more attention for its low production cost, high yield and close to natural products.But the establishment of mammary gland bioreactors is a long and costly task, and the random expression of foreign genes also brings a lot of trouble to the work, so before the establishment of large transgenic animal individuals,It is necessary to identify the feasibility of the constructed vector with small animals.In this study, PCR site-directed mutagenesis was used to mutate 125 cysteine from natural human interleukin-2 to serine.The upstream regulatory sequence of 尾 -lactoglobulin (BLGG) gene of 867bp was amplified from goat fresh blood by Ser-125 mutant human interleukin-125HuIL-2cDNA.Then the upstream regulatory sequence of goat 尾 -lactoglobulin gene was fused with Ser-125 mutant human interleukin-2 cDNA to construct the pBLG-Ser-125HuIL-2 mammary gland localization expression vector.After purification, the expression vector was encapsulated with liposome and injected into the mammary gland of rabbits and goats in the second trimester of pregnancy for transient expression.The content of Ser-125HuIL-2 in milk of rabbits and goats was determined by ELISA method.Six rabbits were made, one of them was used as a blank control, one was injected with liposome-encapsulated pIL-2 plasmid, two were injected with expression vector and two were injected with liposome-encapsulated expression vector.Results No expression was found in two rabbits injected with blank control and pIL-2 plasmid. The expression rate of 1 rabbit was 0.06 ~ 0.53 渭 g / L ~ (-1), and the success rate of expression was 50 / 1 / 2.
【學位授予單位】：南京師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2005
【分類號】：R392

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本文編號：1702728