本文選題：反相微乳法　切入點(diǎn)：免疫磁性微球　出處：《華中科技大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 磁性高分子微球是通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ垢叻肿优c無(wú)機(jī)物結(jié)合起來(lái)形成具有一定磁性及特殊結(jié)構(gòu)的微球,其表面可賦予多種反應(yīng)性功能基團(tuán),如-OH,-COOH和-NH2等,具有良好的生物相容性,通過(guò)與生物活性物質(zhì)中的配基偶聯(lián),能夠識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的抗原、抗體或核酸等,然后可在外加磁場(chǎng)中進(jìn)行分離富集。因此,磁性高分子微球在細(xì)胞分離、固定化酶、靶向藥物和免疫檢測(cè)等生物學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。本課題旨在制備一種新型的納米磁性復(fù)合微球,此種納米級(jí)別的微球與普通的微球相比磁響應(yīng)敏感度極高,同時(shí)具有超順磁特性,在液相分散體中不易聚集、穩(wěn)定性高,其比表面積非常大,負(fù)載蛋白質(zhì)的能力強(qiáng),將其制備免疫磁性微球可作為公共載體和分離工具。然后同免疫分析技術(shù)和化學(xué)發(fā)光技術(shù)相結(jié)合,設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)出新一代磁性富集、檢測(cè)系統(tǒng)和磁性化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)用于腫瘤早期診斷。此種檢測(cè)方法的建立,將會(huì)帶來(lái)巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。 1.反相微乳-包埋方法制備磁性海藻酸鈉復(fù)合微球 以正庚烷為油相,AOT為表面活性劑,海藻酸鈉水溶液和碳包鐵納米顆�；旌献鳛樗�,在高速攪拌和超聲的條件下形成微乳液,加入氯化鈣和環(huán)氧氯丙烷進(jìn)行交聯(lián)固化制備磁性海藻酸鈉復(fù)合微球。系統(tǒng)地考察了反應(yīng)過(guò)程中海藻酸鈉的濃度、表面活性劑的濃度及攪拌速度對(duì)所制微球性能的影響,并對(duì)微球進(jìn)行了初步的性能表征。實(shí)驗(yàn)證明此方法克服了目前磁性高分子微球單分散性差、磁響應(yīng)性弱和粒徑偏大的缺點(diǎn),得到外觀為球形、分散性好、平均粒徑為279nm、具有強(qiáng)的磁響應(yīng)性的磁性高分子微球。 2.在磁性微球表面交聯(lián)抗體制備免疫磁性海藻酸鈉復(fù)合微球 研究磁性復(fù)合微球表面化學(xué)基團(tuán)的植入方法,在微球表面接入6-氨基正己酸“手臂”分子,將功能基團(tuán)的手臂延伸6個(gè)碳原子長(zhǎng)度,然后以兩步法蛋白縮和的方法將羊抗鼠IgG二抗與微球聯(lián)接,制備免疫磁性微球,并對(duì)抗體交聯(lián)微球的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)證明用此方法制備的免疫磁性微球抗體吸附量達(dá)111.2μg/mg,交聯(lián)抗體后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)98.3%的磁性微球具有免疫活性。 3.建立腫瘤細(xì)胞磁性富集與檢測(cè)系統(tǒng),對(duì)肺癌患者外周血微轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞進(jìn)行臨床驗(yàn)證 制備羊抗鼠IgG二抗包被的免疫磁性微球,將免疫磁性分離技術(shù)與免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)相結(jié)合建立肺癌細(xì)胞磁性富集與檢測(cè)系統(tǒng)。鑒定該檢測(cè)系統(tǒng)的特異性、靈敏性和穩(wěn)定性,并進(jìn)行肺癌患者外周血腫瘤細(xì)胞的臨床驗(yàn)證。與單純的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)技術(shù)及RT-PCR檢測(cè)技術(shù)相比較,本論文建立的磁性富集與檢測(cè)系統(tǒng)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和穩(wěn)定性好的特點(diǎn),進(jìn)行肺癌臨床驗(yàn)證結(jié)果顯示本檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)率與RT-PCR檢測(cè)技術(shù)所檢測(cè)的結(jié)果相當(dāng),無(wú)顯著性差異(p0.05),同時(shí)無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn),比單純的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)技術(shù)檢出率高,存在顯著差異(p0.05)。 4.建立磁性化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng),應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物AFP的測(cè)定。 制備羊抗兔IgG二抗包被的免疫磁性微球,將免疫磁性分離技術(shù)與化學(xué)發(fā)光技術(shù)相結(jié)合,建立磁性化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng),優(yōu)化檢測(cè)系統(tǒng)的條件,鑒定其特異性、靈敏性和穩(wěn)定性,并應(yīng)用于患者外周血AFP的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)證明本論文建立的磁性化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和穩(wěn)定性好的特點(diǎn),進(jìn)行患者外周血AFP的測(cè)定結(jié)果有很好的臨床相符性。 本研究制備的新型納米磁性復(fù)合微球,以碳包鐵(Fe@C)納米顆粒作為磁性內(nèi)核,解決了氧化鐵內(nèi)核磁性能不夠的難題,性能優(yōu)良;在交聯(lián)抗體時(shí)于微球與抗體之間連接一個(gè)手臂分子,避免了由于位阻效應(yīng)導(dǎo)致的微球表面抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合不完全的弊端,更有利于微球功能的發(fā)揮。在此基礎(chǔ)上,納米磁性復(fù)合微球作為公共載體和分離工具應(yīng)用于磁性富集與檢測(cè)系統(tǒng)和磁性化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng),實(shí)驗(yàn)證明方便易行,具有廣泛的應(yīng)用前景。 目的:構(gòu)建生物素-蛋白連接酶(BirA酶)基因的表達(dá)載體,并在大腸桿菌BL-21 (DE3)中表達(dá)具有生物學(xué)活性的BirA酶。 方法:用PCR法擴(kuò)增BirA酶基因。將PCR產(chǎn)物克隆入pGEX-4T-2中構(gòu)建BirA酶-GST融合蛋白基因的重組表達(dá)載體pGEX-BirA。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后,在大腸桿菌BL-21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物采用谷胱苷肽-瓊脂糖層析柱進(jìn)行純化。以帶有生物素酶底物肽(BirA substrate peptide, BSP)的HLA-A2-肽復(fù)合物為底物,用ELISA和Western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物的生物素化活性。 結(jié)果:成功地構(gòu)建了pGEX-BirA原核表達(dá)質(zhì)粒,并在大腸桿菌BL-21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)Mr為61300的BirA酶-GST融合蛋白,表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)谷胱苷肽-瓊脂糖層析柱純化后,得到N端帶有GST標(biāo)簽的BirA酶蛋白。ELISA和Western blot的結(jié)果顯示,表達(dá)產(chǎn)物具有酶活性,能使HLA-A2-肽復(fù)合物生物素化。 結(jié)論:成功地制備了具有生物學(xué)活性的BirA酶,為研究蛋白質(zhì)分子的相互作用提供了有效的制劑。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R730.4;R346

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本文編號(hào)：1695727