本文選題：鋅指蛋白A20　切入點：內(nèi)毒素　出處：《重慶醫(yī)科大學》2007年博士論文

【摘要】： 內(nèi)毒素血癥是由于血中細菌或病灶內(nèi)細菌釋放出大量內(nèi)毒素至血液,或輸入大量內(nèi)毒素污染的液體而引起,引起炎癥的激活及細胞因子的釋放,致炎和抗炎失衡,導致全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)、多器官功能不全綜合征(multipal organ disfunction syndrome,MODS)甚至多臟器功能衰竭(multipal organ failure,MOF),是兒科創(chuàng)傷和感染患者死亡的主要原因之一。目前在國內(nèi)外針對內(nèi)毒素血癥的治療措施有:常規(guī)抗生素使用、抗內(nèi)毒素抗體、抗細胞因子抗體等免疫療法、腸道屏障的保護等。盡管治療措施不斷更新進展,內(nèi)毒素血癥的支持、對癥治療已取得很大進步,但由于隨著耐藥菌的不斷產(chǎn)生及對癥支持、輔助療法效果有限,內(nèi)毒素血癥依然是醫(yī)務工作者久攻不克但又必須攻克的堡壘。防治內(nèi)毒素血癥的根本問題是如何有效的控制由內(nèi)毒素血癥誘導的炎癥因子的級聯(lián)放大的“瀑布”樣效應。 鋅指蛋白A20是一種存在胞漿中的泛素修飾蛋白,針對其研究已成為抗炎、抗凋亡研究的熱點問題。研究指出:不需要N端,僅含4個鋅指結(jié)構(gòu)的A20就可以得到與7個鋅指結(jié)構(gòu)的野生型A20同樣的對NF-κB的抑制效果;也有研究指出A20通過其N端及C端的雙泛素修飾功能抑制NF-κB的活化。A20是通過特定的信號通路抑制NF-κB活化,從而抑制炎癥介質(zhì)和細胞因子的釋放,參與對機體炎癥反應調(diào)節(jié)和凋亡調(diào)控。 本研究旨在通過動物實驗,在前期工作的基礎上,從基因水平采用“基于流體動力學基因轉(zhuǎn)染體方法”和脂質(zhì)體介導,體外給予編碼mA20及其突變體mA20-ZnF4-7的真核表達載體pCAGGS- flagmA20及pCAGGS-flagmA20ZnF4-7,以抑制內(nèi)毒素血癥時過多的炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,中斷炎癥的“瀑布”樣效應,糾正炎性失衡,阻止內(nèi)毒素血癥的惡化的發(fā)展。該研究為mA20及其突變體的臨床應用提供實驗基礎。同時本課題擬采用分子設計思想,對人類鋅指蛋白hA20基因進一步設計:保留部分N端及完整的4-7個鋅指結(jié)構(gòu),刪除hA20中的第332位到第1778位基因,構(gòu)建hA20突變體質(zhì)粒pcDNA3-Flagh 20N-ZnF4-7;采用編碼hA20及其突變體的真核表達載體pcDNA3- laghA20及pcDNA3-FlaghA 20N-ZnF4-7,通過細胞表達初步實驗,驗證其是否具有抗炎活性,為探索體外人工合成這種結(jié)構(gòu)新型的具有抗炎作用的蛋白提供前期基礎,為生產(chǎn)新型治療內(nèi)毒素血癥的藥物鋪平道路。 第一部分基于流體動力學轉(zhuǎn)染mA20及其突變體對內(nèi)毒素血癥的治療作用 目的研究mA20及其突變體mA20-ZnF4-7質(zhì)粒對脂多糖(LPS)攻擊所致實驗性內(nèi)毒素血癥的治療作用。 方法用LPS攻擊小白鼠制備內(nèi)毒血癥動物模型。將實驗動物隨機分為:生理鹽水組、單純內(nèi)毒素組、空質(zhì)粒組、mA20質(zhì)粒治療組和mA20-ZnF4-7質(zhì)粒治療組。按10μg質(zhì)粒:1.6ml生理鹽水比例把質(zhì)粒溶于生理鹽水中,采用基于流體動力學基因轉(zhuǎn)染方法對實驗組小鼠進行質(zhì)粒治療性注射。以ELISA檢測各組血漿TNF-α、IL-1β表達;以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測白細胞中mA20及其突變體mRNA的表達;12小時觀察組織病理變化。 結(jié)果(1) mA20質(zhì)粒治療組、mA20-ZnF4-7質(zhì)粒治療組的TNF-α在各時間點的表達(pg/ml)分別為: 6h : (201.797±4.789)、(235.710±6.108) , 12h : (236.580±7.497)、(255.130±7.827) , 24h :(154.551±16.460)、(223.246±11.316) ;該兩組之間無顯著性差異(p0.05);與單純內(nèi)毒素組、空質(zhì)粒組的TNF-α表達比較有顯著性降低(p0.05)。mA20質(zhì)粒治療組、mA20-ZnF4-7質(zhì)粒治療組的IL-1β在各時間點的表達(pg/ml)分別為:6h:(87.103±3.840)、(101.586±2.486),12h : (83.655±4.973)、(94.460±3.110) , 24h : (77.678±6.555) ,(87.103±4.826);該兩組之間無顯著性差異(p0.05);與單純內(nèi)毒素組、空質(zhì)粒組的IL-1β表達比較有顯著性降低(p0.05);各時間點之間比較無明顯差別(p0.05)。(2) mA20質(zhì)粒治療組、mA20-ZnF4-7質(zhì)粒治療組的mA20及其突變體mRNA表達與空質(zhì)粒組、單純內(nèi)毒素組、生理鹽水組比較有顯著性升高(p0.01)。空質(zhì)粒組、單純內(nèi)毒素組的mA20及其突變體mRNA表達與生理鹽水組比較有顯著性升高(p0.05);各時間點之間比較無明顯差別(p0.05)。(3)病理學觀察結(jié)果顯示:mA20治療組、mA20-ZnF4-7治療組的肝、肺損傷均較單純內(nèi)毒素組、空質(zhì)粒組輕;與生理鹽水對照組相比,肝、肺損傷無明顯差別。 結(jié)論“基于流體動力學的基因轉(zhuǎn)染方法”能有效地把目的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入肝、肺;對實驗性類毒素血癥小鼠體外轉(zhuǎn)染mA20-ZnF4-7和mA20有相似的治療作用,這為其臨床應用提供一定的實驗基礎。 第二部分基于流體動力學轉(zhuǎn)染mA20及其突變體對內(nèi)毒素血癥的預防作用 目的研究mA20及其突變體mA20-ZnF4-7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對LPS攻擊所致實驗性內(nèi)毒素血癥的預防作用。 方法用LPS攻擊小白鼠制備內(nèi)毒血癥動物模型。按10μg質(zhì)粒:1.6ml生理鹽水比例把質(zhì)粒溶于生理鹽水中,采用“基于流體動力學基因轉(zhuǎn)染方法”對實驗組小鼠進行質(zhì)粒預防性注射。以ELISA檢測各組血漿TNF-α、IL-1β表達;以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測白細胞中mA20及其突變體mRNA的表達;12小時觀察組織病理變化。 結(jié)果(1) mA20質(zhì)粒治療組、mA20-ZnF4-7質(zhì)粒治療組的TNF-α在各時間點表達(pg/ml)分別為:6h:(211.942±9.133)、(163.536±0.502),12h:(195.130±26.318)、(206.446±34.797),24h:(182.963±14.527)、(158.029±19.176);與空質(zhì)粒組、單純內(nèi)毒素組的TNF-α表達比較有顯著性降低(p0.05)。mA20質(zhì)粒治療組、mA20-ZnF4-7質(zhì)粒治療組的IL-1β在各時間點表達(pg/ml)分別為: 6h : (137.908±4.487)、(138.598±8.733) , 12h : (137.678±3.539)、(137.448±7.953) , 24h :(129.862±11.602)、(126.873±6.942);與空質(zhì)粒組、單純內(nèi)毒素組的IL-1β表達比較有顯著性降低(p0.05);各時間點之間無顯著性差異(p0.05);(2) mA20質(zhì)粒治療組、mA20-ZnF4-7質(zhì)粒治療組的mA20及其突變體mRNA表達與空質(zhì)粒組、單純內(nèi)毒素組、生理鹽水組比較有顯著性升高�？召|(zhì)粒組、單純內(nèi)毒素組的mA20及其突變體mRNA表達與生理鹽水組比較有顯著性升高;各時間點之間無顯著性差異(p0.05);(3)病理觀察結(jié)果顯示,mA20質(zhì)粒治療組、mA20-ZnF4-7質(zhì)粒治療組的肝、肺損傷均較空質(zhì)粒組、單純內(nèi)毒素組輕;與生理鹽水組相比,肝、肺損傷無明顯差別。 結(jié)論“基于血流動力學的基因轉(zhuǎn)染方法”能有效果地把目的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入肝、肺,對實驗性內(nèi)毒素血癥小鼠體外轉(zhuǎn)染mA20-ZnF4-7和mA20有相似的預防作用,這也為臨床應用進一步提供一定的實驗基礎。 第三部分脂質(zhì)體包裹mA20及其突變體對內(nèi)毒素血癥的治療作用 目的研究脂質(zhì)體包裹A20及其突變體mA20-ZnF4-7質(zhì)粒對LPS攻擊所致實驗性內(nèi)毒素血癥的治療作用。 方法用LPS攻擊小白鼠制備內(nèi)毒素血癥動物模型。隨機分為:生理鹽水對照組(NS組)、單純內(nèi)毒素組、空質(zhì)粒組、脂質(zhì)體包裹mA20質(zhì)粒治療組(L-mA20組)、脂質(zhì)體包裹mA20?質(zhì)粒治療組(L-mA20?組)。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體,并按200μl脂質(zhì)體:10μg質(zhì)粒的比例作為每只小鼠的使用量。采用尾靜脈注射脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒的溶液,提取血漿、分離白細胞、留取肝肺;以ELISA檢測各組血漿TNF-α、IL-1β表達;以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測白細胞中mA20極其突變體mRNA的表達;并于12小時點觀察組織病理變化。 結(jié)果(1) L-mA20組和L-mA20?組的TNF-α在各時間點表達(pg/ml)分別為: 6h : (304.696±6.087)、(304.985±6.291) , 12h :(321.217±10.579)、(256.580±33.524) , 24h : (307.594±11.181)、(280.348±11.698);與單純內(nèi)毒素組、空質(zhì)粒組的TNF-α表達比較有顯著性降低(p0.05)。L-mA20組和L-mA20?組的IL-1β在各時間點表達(pg/ml)分別為: 6h : (256.989±3.921 )、(263.655±5.645), 12h :(205.724±4.827)、(154.690±1.380),24h:(165.724±7.772)、(101.816±3.259);依時間有顯著性下降趨勢;與單純內(nèi)毒素組、空質(zhì)粒組的IL-1β表達比較有顯著性降低(p0.05);L-mA20?組24h點的IL-1β與6h點比較有顯著性降低(p0.05);(2) mA20質(zhì)粒治療組、mA20-ZnF4-7質(zhì)粒治療組的mA20及其突變體mRNA表達與空質(zhì)粒組、單純內(nèi)毒素組、生理鹽水組比較有顯著性升高。空質(zhì)粒組、單純內(nèi)毒素組的mA20及其突變體mRNA表達與生理鹽水組比較有顯著性升高;(3)病理觀察結(jié)果顯示:L-mA20組和L-mA20?組的肝、肺損傷均較單純內(nèi)毒素組、空質(zhì)粒組輕;與NS相比,肝、肺損傷無明顯差別。 結(jié)論尾靜脈注射脂質(zhì)體包裹mA20及其突變體mA20-ZnF4-7質(zhì)粒對內(nèi)毒素血癥小鼠有相似的治療作用,為臨床用脂質(zhì)體包裹質(zhì)粒DNA治療內(nèi)毒素血癥作好鋪墊,為臨床應用結(jié)構(gòu)更簡單的A20蛋白提供了一定實驗基礎。 第四部分人鋅指蛋白A20基因突變提構(gòu)建及真核表達初步研究 目的采用分子設計軟件設計并構(gòu)建人鋅指蛋白A20基因突變體,轉(zhuǎn)染小鼠RAW264.7真核表達細胞,檢測其對LPS刺激的RAW264.7細胞的抗炎活性。 方法采用分子設計軟件對hA20基因進行分析,把第332位到第1778位基因剔除。使用核酸內(nèi)切酶AccⅢ酶切真核表達質(zhì)粒pcDNA3- FlaghA20,使其成線性后。再采用DNA連接酶對質(zhì)粒進行自連反應,將重組子轉(zhuǎn)染JM109,挑取菌落,用PCR和酶切方法鑒定真假陽性克隆。使用小鼠RAW264.7巨噬細胞作為研究對象,并完全隨機分為:單純LPS刺激組、hA20全長質(zhì)粒組和hA20N-ZnF4-7質(zhì)粒組。應用Lipofectamine2000真核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)轉(zhuǎn)染LPS刺激的RAW264.7細胞,用ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清的TNF-α、IL-1β表達變化。 結(jié)果通過PCR、酶切可見部分克隆片段只為923bp,即全長hA20經(jīng)AccⅢ酶切后的片段;送檢測序,顯示構(gòu)建成功;RAW264.7細胞培養(yǎng)上清的TNF-α、IL-1β表達(pg/ml)分別為:單純LPS刺激組:(250.10±60.18)、(221.33±30.02);hA20全長質(zhì)粒組:(120.87±33.75)、(69.21±13.18);hA20N-ZnF4-7質(zhì)粒組:(116.51±22.82)、(63.45±12.73)。 結(jié)論:我們成功的構(gòu)建了hA20突變體質(zhì)粒pcDNA3.0- Flag-hA20N-ZnF4-7,其對LPS攻擊的RAW264.7細胞有明顯的抗炎活性,為后續(xù)的進一步真核表達研究作好鋪墊。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R363

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本文編號：1687767