本文選題：人胚胎干細(xì)胞　切入點(diǎn)：定向分化　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2006年博士論文

【摘要】： 人胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及后者遷移機(jī)制的研究 目的：探討人胚胎干細(xì)胞(hESC)向造血-內(nèi)皮系誘導(dǎo)分化的能力，將hESC定向分化為高純度的hESC來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞，為hESC應(yīng)用于構(gòu)建組織工程血管提供依據(jù)。以hESC作為研究載體，建立模仿人胚胎發(fā)育過(guò)程中血管生成的芽生EB模型，探究SDF-1/CXCR4軸對(duì)人類胚胎干細(xì)胞來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管生成的影響。 材料與方法：1．選用人胚胎干細(xì)胞系(NIH人胚胎干細(xì)胞登記署登記號(hào)為：WA01和09，簡(jiǎn)稱為H1、H9)為研究對(duì)象。將未分化hESC培養(yǎng)在經(jīng)絲裂霉素或照射滅活的小鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，每日換液一次，第5-7天后進(jìn)行細(xì)胞傳代，檢測(cè)細(xì)胞表面期特異性抗原SSEA(Stage specific embryonic antigen)-1、SSEA-4、TRA(tumor rejection antigen)-1-60、TRA-1-81的表達(dá)以明確細(xì)胞是否屬于未分化狀態(tài)。2．以與小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(OP9)共培養(yǎng)或以懸浮類胚體(embryo body，EB)形式進(jìn)行造血-內(nèi)皮系誘導(dǎo)分化，每2-3日換液一次。檢測(cè)分化過(guò)程中細(xì)胞表面SSEA-1、SSEA-4、和造血-內(nèi)皮系轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因(GATA-1、SCL、LMO-2、CD31、Tie-2)、以及該二系細(xì)胞表面標(biāo)志的變化，并以半固體培養(yǎng)基進(jìn)行造血集落的培養(yǎng)。3．以磁珠分選分化后H1來(lái)源CD34~+細(xì)胞，將這部分細(xì)胞置于內(nèi)皮培養(yǎng)體系再誘導(dǎo)，獲取一群類似于成人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的貼壁細(xì)胞，并對(duì)這部分細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞的性質(zhì)鑒定，包括CD31、CD34、Flk-1、VE-Cadherin和vWF等表面標(biāo)記的表達(dá)、吞噬LDL的能力以及在Matrigel基質(zhì)表面形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的能力等。4．將分化后EB置于膠原基質(zhì)和VEGF、FGF等血管生成因子的混合體系中，進(jìn)行芽生EB的誘導(dǎo)，摸索該體系的最佳培養(yǎng)條件，包括EB的時(shí)齡、培養(yǎng)的時(shí)間、VEGF/FGF的濃度組合等，并進(jìn)行芽生結(jié)構(gòu)內(nèi)皮系性質(zhì)的鑒定，如：CD31熒光標(biāo)記和血管生成抑制因子對(duì)芽狀結(jié)構(gòu)的抑制作用等。5．以RT-PCR法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)H1分化不同階段、H1來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞中CXCR4和SDF-1的表達(dá)水平。將20μl hESC來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞置于微孔膜一側(cè)，微孔膜另一側(cè)加入不同濃度梯度的SDF-1，以ChemoTx系統(tǒng)進(jìn)行H1來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞向SDF-1的跨膜遷移能力檢測(cè)。以外源性SDF-1上調(diào)SDF-1/CXCR4軸、或以AMD3100、CXCR4抗體阻斷SDF-1/CXCR4的相互結(jié)合，觀察這些調(diào)節(jié)作用對(duì)H1來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力、以及hESC來(lái)源原始血管生成的影響。 結(jié)果：1．未分化hESC集落表現(xiàn)為圓形或橢圓形、平坦、細(xì)胞排列緊密的細(xì)胞團(tuán)，表達(dá)SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81等未分化hESC的特異性標(biāo)志，，但不表達(dá)SSEA-1。隨著細(xì)胞分化程度的提高，SSEA-4的表達(dá)逐漸減弱，而SSEA-1的表達(dá)進(jìn)行性升高。2．HESC與小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)或以EB形式誘導(dǎo)分化后，原本在未分化狀態(tài)時(shí)不表達(dá)的造血-內(nèi)皮系基因在RT-PCR檢測(cè)時(shí)逐漸顯示陽(yáng)性條帶，而未分化基因Oct-4的表達(dá)逐漸減弱，中胚層標(biāo)志基因Brachyury在分化后第6天左右消失。VEGF-R2(Flk-1)在未分化hESC中也有一定程度的表達(dá)，隨著分化程度的提高，F(xiàn)lk-1的表達(dá)程度也逐漸上升。3．細(xì)胞在分化后開(kāi)始表達(dá)CD34這一造血/內(nèi)皮系共同標(biāo)記，且在第12天左右達(dá)到峰值，同期也獲得了最多的造血集落數(shù)。此后，CD34的陽(yáng)性率和造血集落的數(shù)量逐漸減弱，但粒-巨噬系集落占所有造血集落的比例卻逐漸上升。4．我們選擇分化后第10天-12天這一CD34表達(dá)高峰期為分選時(shí)機(jī)，以磁珠分選的方法分選hESC來(lái)源CD34~+細(xì)胞，CD34~+細(xì)胞的純度達(dá)到90％以上，這部分細(xì)胞同時(shí)還表達(dá)高水平的CD31、但不表達(dá)CD45。將hESC來(lái)源CD34~+細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系中進(jìn)一步分化成熟，所獲得的貼壁細(xì)胞形態(tài)類似于成熟人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，具有成熟內(nèi)皮細(xì)胞的特征，表達(dá)高水平的CD31、CD34、Flk-1、VE-Cadherin和vWF，能吞噬Dil-AcLDL，在Matrigel基質(zhì)表面形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。5．將分化第11天的EB置于含有VEGF、FGF的膠原基質(zhì)中，從EB中可以伸展出有內(nèi)皮細(xì)胞積聚的、類似于血管腔樣結(jié)構(gòu)的芽狀分支，為芽生EB。芽生EB間還可形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，是研究人類胚胎發(fā)育過(guò)程中血管生成的一種模型。6．HESC的各個(gè)分化階段、hESC來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞表面都表達(dá)有CXCR4，而且VEGF可以上調(diào)細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)水平。HESC來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞可以順SDF-1濃度梯度出現(xiàn)向SDF-1的跨膜遷移，SDF-1可以增強(qiáng)hESC來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞的伸展和相互接觸，促進(jìn)由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)的形成。阻斷SDF-1和CXCR4的相互作用可以破壞內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、抑制芽狀結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)、切斷芽生EB間的聯(lián)系。 結(jié)論：1．在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層上，人胚胎干細(xì)胞系能夠無(wú)限增殖并保持其未分化狀態(tài)。2．在小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞表面或以懸浮EB形式，未分化hESC能夠進(jìn)入中胚層途徑，向造血-內(nèi)皮系進(jìn)一步分化。分化后細(xì)胞逐漸表達(dá)造血/內(nèi)皮系表面標(biāo)記，SSEA-4、Oct-4等未分化標(biāo)志的表達(dá)則明顯減弱。3．分化后第12天左右，hESC來(lái)源的造血細(xì)胞大量涌現(xiàn)，隨著分化程度的加深，細(xì)胞有逐步脫離原始胚胎造血階段的可能。4．選擇分化后第10天-12天這一CD34近高峰期為分選時(shí)機(jī)，可以獲得高純度的hESC來(lái)源CD34陽(yáng)性細(xì)胞，而且這部分細(xì)胞可以進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞。因此，我們已經(jīng)建立了一種將hESC 定向分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法。5．HESC來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)有SDF-1/CXCR4這一趨化因子配體/受體對(duì)，SDF-1/CXCR4可以調(diào)節(jié)hESC來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。VEGF可能通過(guò)上調(diào)細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)而促進(jìn)芽生EB的生成，與SDF-1/CXCR4共同介導(dǎo)人胚胎發(fā)生過(guò)程中原始血管網(wǎng)的形成。
[Abstract]:Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Vascular Endothelial Cells and Study of the Mechanism of Migration ;









Objective : To investigate the ability of human embryonic stem cells ( hESC ) to induce differentiation of human embryonic stem cells ( hESC ) into high - purity hESC - derived endothelial cells and to provide the basis for the application of hESC in the construction of tissue engineering vessels . Using hESC as the research carrier , an EB model of angiogenesis in human embryonic development was established , and the effects of SDF - 1 / CXCR4 axis on migration and angiogenesis of human embryonic stem cells derived from human embryonic stem cells were investigated .









Materials and Methods : 1 . Human embryonic stem cell line ( NIH human embryonic stem cell registration number : WA01 and 09 , abbreviated as H1 , H9 ) was used as the research object . Undifferentiated hESC was cultured on the feeder layer of mouse fibroblast feeder irradiated with mitomycin or irradiation . After 5 - 7 days , the expression of specific antigen SSEA ( Stage specific embryonic antigen ) -1 , SSEA - 4 , TRA ( tumor rejection antigen ) -1 - 60 , TRA - 1 - 81 was detected to determine whether the cell belonged to undifferentiated state . The cell surface SSEA - 1 , SSEA - 4 , and hematopoietic - endothelial transcription regulatory genes ( GATA - 1 , SCL , LMO - 2 , CD31 , Tie - 2 ) and the changes of surface markers of the two - line cells were detected in the differentiation process . CD34 + cells were isolated from human umbilical vein endothelial cells by magnetic beads . The cells were then cultured in endothelial culture system to obtain a group of adherent cells similar to adult human umbilical vein endothelial cells . The properties of these cells were identified , including the expression of surface markers such as CD31 , CD34 , Flk - 1 , VE - cadherin and VWF , the ability to phagocytize LDL and the ability to form reticular formation on the surface of Matrigel matrix . EB was induced by EB in the mixed system of angiogenic factors such as collagen matrix and VEGF and FGF . The optimal culture conditions of EB were determined , including the age of EB , the time of culture , the concentration of VEGF / FGF , and the identification of the properties of the endothelial system of the bud structure , such as the inhibitory effect of CD31 fluorescent label and angiogenesis inhibiting factor on the bud structure . The expression levels of CXCR4 and SDF - 1 in H1 - derived endothelial cells were detected by RT - PCR and flow cytometry .









Results : 1 . The expression of SSEA - 4 , TRA - 1 - 60 , TRA - 1 - 81 did not express SSEA - 1 . The expression of VEGF - R2 ( Flk - 1 ) in undifferentiated hESC was gradually decreased , and the expression of Flk - 1 increased gradually with the increase of differentiation degree . After differentiation , the CD34 + hematopoietic / endothelial cells were labeled and peaked at about 12 days , and the most hematopoietic colonies were obtained in the same period . After that , the positive rate of CD34 and the number of hematopoietic colonies decreased gradually , but the proportion of the granulocyte - macrophage colony to all hematopoietic colonies increased gradually . CD34 ~ + cells were isolated from human umbilical vein endothelial cells . The results showed that CD34 ~ + cells were mature in endothelial cells . The morphology of CD34 ~ + cells was similar to that of mature human umbilical vein endothelial cells . EB in the 11th day was placed in the collagen matrix containing VEGF and FGF . The accumulation of endothelial cells could be exhibited from EB . It was similar to the bud - like branch of the vascular cavity - like structure . It was also a model of angiogenesis in the development of human embryo . The expression level of CXCR4 is expressed on the endothelial cell surface of hESC , and the expression level of CXCR4 in the cell surface can be regulated by the VEGF . The migration of SDF - 1 to SDF - 1 can be enhanced by SDF - 1 . The interaction between SDF - 1 and CXCR4 can destroy the network structure of endothelial cells , inhibit the growth of bud - like structure , and cut off the relationship between budding and EB .









Conclusion : 1 . Human embryonic stem cells were able to proliferate and maintain their undifferentiated state on mouse embryonic fibroblast growth layers . In the mouse bone marrow stromal cell surface or in the form of suspension EB , the undifferentiated hESC was able to enter the mesoderm pathway to further differentiate into the hematopoietic - endothelium system . After differentiation , the cells gradually expressed hematopoietic / endothelial system surface markers , and the expression of SSEA - 4 , Oct - 4 and other undifferentiated markers decreased significantly . At the 12th day after differentiation , the hematopoietic cells of hESC origin are emerging , and with the deepening of differentiation degree , the cells are gradually separated from the possible hematopoietic stage of the original embryo . High - purity hESC - derived CD34 - positive cells can be obtained by selective differentiation from 10 to 12 days after differentiation , and these cells can be further induced to differentiate into mature vascular endothelial cells .









Directional differentiation into mature vascular endothelial cells . The expression of SDF - 1 / CXCR4 and SDF - 1 / CXCR4 in HESC - derived endothelial cells can regulate the migration of endothelial cells from hESC .

【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：1677332