發(fā)布時(shí)間：2018-03-25 09:36

  本文選題：GITR　切入點(diǎn)：原核表達(dá)　出處：《江蘇大學(xué)》2007年碩士論文

【摘要】： 目的：克隆人類糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體(human glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，hGITR)基因，原核表達(dá)并純化hGITR胞外段融合蛋白；制備針對(duì)hGITR胞外段融合蛋白的兔源性多抗并加以鑒定，并探討該多抗對(duì)CD4~+T細(xì)胞增殖能力的影響。為進(jìn)一步研究人類GITR/GITRL的分子作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法： 1)采用RT-PCR方法，從正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞獲得hGITR基因的cDNA，克隆至pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α宿主菌，行藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落進(jìn)一步行酶切以及PCR鑒定，將初步確定的陽(yáng)性克隆測(cè)序鑒定。 2)以PCR方法從陽(yáng)性TA克隆中獲得hGITR胞外段(hGITR_(aa27-165))基因，連接至pQE30質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli JM109宿主菌，選擇陽(yáng)性株，抽提質(zhì)粒，進(jìn)行BamHI、HindⅢ雙酶切及PCR鑒定。 3)以陽(yáng)性重組質(zhì)粒pQE30-hGITR_(aa27-165)轉(zhuǎn)化E.coli M15宿主菌，通過(guò)酶切、PCR鑒定陽(yáng)性菌株。接種陽(yáng)性菌于3ml氨芐抗性的LB培養(yǎng)基，37℃，250rpm，12～16小時(shí)，，以1/100的比例接種新鮮LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600≈0.6時(shí)，分別加入終濃度為0.5、0.75、1mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，分別在25℃、30℃、37℃繼續(xù)振搖培養(yǎng)，0,2,4,6,8小時(shí)分別取菌液離心收集細(xì)菌，通過(guò)SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)蛋白，確定最適IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間，將所表達(dá)的hGITR_(aa27-165)融合蛋白用Profinity IMAC Ni-Charged Resin親和層析柱分離純化，純化后蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳及Western Blot鑒定。 4)將hGITR_(aa27-165)融合蛋白與弗氏佐劑充分乳化后，免疫家兔，制備抗hGITR胞外段抗血清，并以Protein A Sepharose柱純化、交叉吸附去除非特異性抗體，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測(cè)其效價(jià)，Western Blot及流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)鑒定多克隆抗體特異性，以多克隆抗體刺激CD4~+T細(xì)胞，通過(guò)~3H-TdR摻入法檢測(cè)CD4~+T細(xì)胞的增殖狀況。 結(jié)果： 1)成功構(gòu)建pGEM-T-GITR載體。測(cè)序結(jié)果顯示連接至pGEM-T載體的目的片段—hGITR基因，編碼區(qū)cDNA的全長(zhǎng)726bp，編碼241個(gè)氨基酸殘基，與GenBank中發(fā)表的序列完全一致。2)成功構(gòu)建pQE30-hGITR_(aa27-165)原核表達(dá)重組質(zhì)粒。PCR及BamHI、HindⅢ雙酶切后，均可見(jiàn)417bp目的條帶，測(cè)序結(jié)果通過(guò)Pubmed Blast發(fā)現(xiàn)與GenBank中的序列一致。確定終濃度0.5mmol/L IPTG，溫度30℃，誘導(dǎo)時(shí)間6h為最佳誘導(dǎo)條件，通過(guò)Profinity IMAC Ni-Charged Resin親和層析柱純化目的蛋白，獲得原核表達(dá)的hGITR_(aa27-165)融合蛋白，大小約為15.6KD。 3)免疫家兔獲得抗hGITR_(aa27-165)融合蛋白多克隆抗體�？贵w經(jīng)純化處理后ELISA檢測(cè)效價(jià)為1:1.6×10~5，Western Blot與FCM檢測(cè)顯示其具有較好反應(yīng)性和特異性，并且該多抗可以增強(qiáng)CD4~+T細(xì)胞的增殖能力。 結(jié)論：成功構(gòu)建pGEM-T-hGITR載體并獲得原核表達(dá)的hGITR_(aa27-165)融合蛋白，制備抗hGITR_(aa27-165)融合蛋白多克隆抗體，初步試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)抗hGITR_(aa27-165)融合蛋白多克隆抗體對(duì)CD4~+T細(xì)胞具有促增殖作用。為進(jìn)一步研究GITR/GITRL相互作用的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: to clone human glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor (human glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor, hGITR) gene, prokaryotic expression and purification of hGITR ectodomain fusion protein; preparation for rabbit derived hGITR ectodomain fusion protein against and identified, and discuss the effect of antibody on CD4~+T cells the proliferation ability. Lay the foundation for further research the molecular mechanism of human GITR/GITRL.
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本文編號(hào)：1662548