本文選題：hypocretin　切入點(diǎn)：藍(lán)斑　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 已經(jīng)知道,hypocretins(orexins)廣泛參與了各種生理功能,如攝食、神經(jīng)內(nèi)分泌、自主活動(dòng)、藥物成癮以及睡眠-覺醒等。Hypocretin通過(guò)兩種G蛋白偶聯(lián)受體Hcrtr 1和Hcrtr2發(fā)揮作用,這些受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有不同的分布。藍(lán)斑(Locus Coeruleus,LC)神經(jīng)元是hypocretin纖維分布比較密集的區(qū)域,并且主要表達(dá)Hcrtr 1。Hypocretins對(duì)LC神經(jīng)元具有之間的促興奮作用。進(jìn)一步地,hypocretins可以促進(jìn)LC神經(jīng)元軸突末梢的去甲腎上腺素(Noradrenaline,NA)遞質(zhì)的釋放。通常囊泡釋放不僅發(fā)生在軸突末梢,而且還可以發(fā)生在細(xì)胞胞體。我們最近的實(shí)驗(yàn)就發(fā)現(xiàn),LC神經(jīng)元即存在胞體NA釋放。綜上所述,加之已經(jīng)發(fā)現(xiàn)hypocretin對(duì)細(xì)胞的主要作用是引起胞內(nèi)鈣離子的升高(這是引起胞體分泌的關(guān)鍵因素),因此我們推測(cè)hypocretins可能對(duì)LC神經(jīng)元胞體分泌具有調(diào)節(jié)作用。 興奮性氨基酸,包括NMDA受體介導(dǎo)的神經(jīng)傳遞是LC神經(jīng)元主要的興奮性傳入,并且參與了各種生理功能。最近已有一些文獻(xiàn)在皮層及腹側(cè)背蓋核神經(jīng)元報(bào)道了hypocretins與谷氨酸/NMDA存在相互作用。然而,到目前為止,HCRT和NMDA對(duì)LC神經(jīng)元的是否也存在相互作用卻未見報(bào)道。在本文中,我們首先研究了HCRT或NMDA是否可以引起LC神經(jīng)元的胞體遞質(zhì)分泌;隨后,我們還研究了HCRT是否可以影響NMDA受體介導(dǎo)的胞體分泌。結(jié)果如下: 1.LC神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)和電生理學(xué)特點(diǎn) 根據(jù)形態(tài)學(xué)和電生理學(xué)特點(diǎn)可以很容易地將LC神經(jīng)元鑒別出來(lái)。在小腦腳平面,大鼠LC核團(tuán)定位于第四腦室兩側(cè),靠近三叉神經(jīng)中腦核內(nèi)側(cè)。急性分離的LC細(xì)胞胞體較大,直徑20～50μm,橢圓形或呈紡錘形,通常有多個(gè)突起。大部分胞體較大的LC神經(jīng)元是去甲腎上腺素能的(TH染色陽(yáng)性)。通過(guò)膜片鉗實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),LC神經(jīng)元平均靜息膜電位為-55.9±0.9 mV,平均輸入阻抗為179.8±0.5 MΩ(n=21)。所有被記錄的LC神經(jīng)元都有自發(fā)放電特性,頻率為0.5～5 Hz,分為兩種放電形式:phasic發(fā)放和tonic發(fā)放。此外,我們?cè)贚C神經(jīng)元分別記錄到電壓依賴性全細(xì)胞Na~+、K~+和Ca~(2+)電流。同時(shí),NA對(duì)LC神經(jīng)元的電興奮性具有顯著的抑制效應(yīng)。 2.HCRT引起LC神經(jīng)元胞體遞質(zhì)釋放 給予100 nM HCRT不能引起LC神經(jīng)元NA分泌信號(hào),而給予相對(duì)的高濃度1μMHCRT則可以引起明顯的反應(yīng)。同樣地,HCRT對(duì)LC神經(jīng)元的直接電興奮性也有劑量依賴效應(yīng),即1μM可以引起反應(yīng),而100 nM則不行。此外,如果提前給予Hcrtr-1受體阻斷劑,1μM HCRT不能引起分泌信號(hào),提示Hcrtr-1受體可能參與介導(dǎo)其作用。當(dāng)用玻璃電極吹去神經(jīng)元胞體表面的組織,使碳纖電極緊密接觸細(xì)胞表面,可以記錄到HCRT引起的單個(gè)尖峰發(fā)放(Amperometri Spikes)。另外,給予1μM河豚毒素(TTX)阻斷樹突和軸突末梢的遞質(zhì)釋放,HCRT引起的分泌信號(hào)只是減小了大約20%。因此,這些結(jié)果提示HCRT在LC區(qū)域引起的遞質(zhì)分泌信號(hào)主要來(lái)源于細(xì)胞胞體。 3.NMDA引起LC神經(jīng)元胞體遞質(zhì)釋放 給予100μM NMDA可以引起LC神經(jīng)元明顯的分泌反應(yīng)。相反,給予正常的人工腦脊液(ACSF),則不能引起反應(yīng)。此外,與100μM相比,20μM和1μM引起相對(duì)較弱的信號(hào),提示NMDA作用具有劑量依賴效應(yīng)。進(jìn)一步地,給予NMDA受體阻斷劑可以完全阻斷NMDA的促分泌作用。因此,這些結(jié)果提示NMDA可以在LC胞體樹突區(qū)域引起單胺類物質(zhì)的分泌。 4.HCRT增強(qiáng)LC神經(jīng)元NMDA受體介導(dǎo)的胞體遞質(zhì)分泌 給予100μM NMDA可以顯著引起分泌信號(hào),隨后用100 nM HCRT處理5 min,再次給予100μM NMDA可引起更大的分泌信號(hào)(增加大約40%)。然而,給予對(duì)照ACSF則不能影響NMDA受體介導(dǎo)的分泌信號(hào)。此外,給予Hcrtr 1受體阻斷劑SB 334867(1μM)可以完全阻斷HCRT對(duì)NMDA作用的增強(qiáng)效應(yīng)。進(jìn)一步地,在給予TTX處理?xiàng)l件下,100 nM HCRT仍然能增強(qiáng)NMDA引起的分泌信號(hào),提示HCRT可以參與調(diào)節(jié)NMDA受體介導(dǎo)的胞體分泌信號(hào)。另外,給予PKC特異性阻斷劑BIS II,HCRT則不能改變NMDA受體介導(dǎo)分泌反應(yīng);而用PKC的激動(dòng)劑PMA處理5 min則可以模擬HCRT的調(diào)節(jié)作用。最后,作為對(duì)照,100 nM HCRT并不能變化高鉀引起的分泌反應(yīng)。因此,這些結(jié)果提示HCRT可以增加LC神經(jīng)元NMDA受體介導(dǎo)的胞體遞質(zhì)分泌,并且這一過(guò)程依賴于PKC信號(hào)途徑。 5.HCRT增強(qiáng)NMDA受體介導(dǎo)的LC神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高 本實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)用無(wú)鈣外液(含1 mM EGTA和200μM Cd~(2+))處理腦片30 min后,100μM NMDA和1μM HCRT均不能引起任何分泌信號(hào),說(shuō)明NMDA和HCRT在LC神經(jīng)元引起的胞體分泌是鈣依賴性的。 低濃度的HCRT(100 nM)不能引起LC神經(jīng)元的鈣濃度升高,而高鉀則可以引起明顯的鈣信號(hào)。同樣地,100μM NMDA也能引起顯著的鈣反應(yīng)。當(dāng)給予100 nM HCRT處理5 min后,再次給予NMDA可引起更大的反應(yīng)。這種增強(qiáng)效應(yīng)可被SB 334867或BIS II阻斷,提示這一過(guò)程可能依賴于Hcrtr 1受體以及PKC信號(hào)途徑。這些結(jié)果與我們的假說(shuō)一致,即HCRT增強(qiáng)的NMDA受體介導(dǎo)的鈣信號(hào)可能參與胞體遞質(zhì)分泌的調(diào)節(jié)。 綜合上述,本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)HCRT或NMDA均可以引起LC神經(jīng)元的胞體遞質(zhì)分泌。而給予HCRT則可增強(qiáng)NMDA受體介導(dǎo)的胞體分泌信號(hào)。這種增強(qiáng)效應(yīng)隨后可被SB334867或BIS II阻斷,說(shuō)明Hcrtr 1受體和PKC可能參與了其中的作用。另外,HCRT還可以增強(qiáng)NMDA受體介導(dǎo)的LC神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高。因此,上述結(jié)果揭示,HCRT既可以調(diào)節(jié)LC靶區(qū)的NA能纖維傳入,又可以參與調(diào)節(jié)LC胞體樹突區(qū)域的NA能信號(hào)傳遞,從而起到對(duì)LC系統(tǒng)活動(dòng)的調(diào)控作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R33

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