本文選題：基因組文庫　切入點：結(jié)核分枝桿菌　出處：《西南大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 結(jié)核分枝桿菌一直是威脅人類健康的主要病原微生物之一，其致病機理至今仍未完全明了。結(jié)核分枝桿菌通過呼吸道入侵人體肺部時，面臨諸多不利因素的脅迫，如缺氧、低pH值、肺部表面活性物質(zhì)等，其中，肺部表面活性物質(zhì)參與了對病原微生物入侵的免疫應(yīng)答，并且使細菌面臨表面活性物質(zhì)的脅迫。研究與此相關(guān)分子機制，不僅能了解結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)存活的機理，而且為消滅它們提供新的線索。 1998年對結(jié)核分枝桿菌H37Rv和CDC1551菌株全基因組測序工作的完成，使得對這種病原微生物的研究上了一個新的臺階。但從全基因組序列分析中得到的4000多個基因中，有16％的基因功能完全未知。這些基因很可能關(guān)系到結(jié)核分枝桿菌對環(huán)境脅迫的應(yīng)答，探索相關(guān)基因的功能，將為深入研究結(jié)核分枝桿菌的致病機理給出新的線索，進而為新藥物的開發(fā)提供可能的靶點。 為研究結(jié)核分枝桿菌參與表面活性物質(zhì)脅迫的相關(guān)基因，提取結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐藥菌株580的基因組DNA，以限制性內(nèi)切酶消化后，在大腸桿菌JM109中構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌基因組文庫，通過IPTG誘導(dǎo)獲得結(jié)核基因在大腸桿菌中的功能性表達，進一步通過一系列梯度濃度的SDS的篩選，從中分離出含有結(jié)核分枝桿菌基因Rv0621的克隆S1。S1可以在空質(zhì)粒對照不能生長的SDS選擇性平板上生長。又因為肺部的表面活性物質(zhì)與陰離子去垢劑SDS在物理性質(zhì)上的相似性，從而推測結(jié)核分枝桿菌Rv0621基因編碼的蛋白在抵御表面活性物質(zhì)脅迫中有相關(guān)作用。 基因Rv0621編碼一個37kDa的蛋白，經(jīng)疏水性分析，推測為含有四個跨膜區(qū)的跨膜蛋白。并具有ATP/GTP結(jié)合位點的保守結(jié)構(gòu)域。作為膜蛋白，推測該分子在結(jié)核菌生存，繁殖致病方面有重要的功能。因為就普遍而言，膜蛋白是一類與生物膜相互作用、具有重要功能和獨特結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。結(jié)核分枝桿菌作為一種廣泛關(guān)注的病原微生物，其膜蛋白的研究具有重要意義。結(jié)核分枝桿菌的細胞被膜有獨特的分子組成和結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)該菌的胞內(nèi)寄生，參與宿主的免疫應(yīng)答，并通過屏蔽或外排藥物導(dǎo)致該菌的耐藥性。研究它們的結(jié)構(gòu)和功能為了 解結(jié)核分枝桿菌的感染機理以及治療結(jié)核病提供重要線索。同時，結(jié)核分枝桿菌的膜蛋白具有一定的代表性，它不僅有與原核生物中功能保守的膜蛋白，還有某些真核生物類似的膜蛋白，如真核樣的腺苷酸環(huán)化酶，真核樣G蛋白等；所有已知的脂質(zhì)、聚酮代謝途徑在分枝桿菌中都能找到，結(jié)核分枝桿菌中脂質(zhì)、聚酮合成酶中，有很多是超出已知的范圍，研究它們還有可能獲得新的脂質(zhì)聚酮合成途徑。 通過序列比對發(fā)現(xiàn)，Rv0621編碼蛋白同其它任何蛋白的序列同源性均不高，所以無法通過信息學(xué)的方法推斷其功能。從其序列的特異性以及其結(jié)構(gòu)的特點推斷，該蛋白有可能成為診斷、治療或者預(yù)防結(jié)核分枝桿菌引發(fā)的疾病的有價值的分子。 依據(jù)序列測定結(jié)果，從GenBank登錄的結(jié)核分枝桿菌H37Rv Rv0621基因序列，設(shè)計引物，從H37Rv的基因組中擴增出基因Rv0621，并將其連入質(zhì)粒pET32a(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得該基因的融合表達產(chǎn)物。通過親和純化得到重組蛋白純品。用原二色譜以及生物信息學(xué)模型分析該蛋白的二級結(jié)構(gòu)，得到該蛋白的α螺旋、β折疊以及無規(guī)則卷曲的含量分別是16.38％，24.58％和59.04％。 通過GC-MS對重組菌和空質(zhì)粒對照菌脂肪酸分析，我們發(fā)現(xiàn)，重組大腸桿菌的油酸(C18△9)的相對含量比空質(zhì)粒對照高。文獻顯示，大腸桿菌在20℃時，油酸含量很低。而結(jié)核分枝桿菌中油酸的含量相對大腸桿菌是很高的。重組菌和空質(zhì)粒對照大腸桿菌的這種差異顯示該基因的重組表達產(chǎn)物對重組菌的脂肪酸組成產(chǎn)生一定的影響。因此推測，它在結(jié)核分枝桿菌基因組中的功能可能與該菌的脂肪酸代謝相關(guān)。 將重組菌和對照菌上清，純化的重組蛋白處理肺癌細胞A549之后，細胞的形態(tài)有一定的改變，推測重組蛋白與細胞可能有相互作用，對細胞產(chǎn)生影響。 從試驗結(jié)果推測，Rv0621編碼的蛋白是一個有意義的分子，，在結(jié)核分枝桿菌的生理，毒理方面都可能有作用。對其繼續(xù)的研究可能揭示很多以前未知的關(guān)于這種致病菌的詳細信息，為我們最終戰(zhàn)勝結(jié)核病提供新的思路。
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本文編號：1638114