本文選題：胎兒　切入點(diǎn)：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞　出處：《青島大學(xué)》2005年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:為糖尿病細(xì)胞替代治療提供理想的種子細(xì)胞,分別行胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)、胎兒胰腺源性干細(xì)胞(PSCs)以及構(gòu)建人自體基因的胚胎干細(xì)胞(SCNT-hES)向胰島樣細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化,動態(tài)觀察誘導(dǎo)分化細(xì)胞形態(tài)的時空變化及階段特異性抗原表達(dá),對終末分化細(xì)胞進(jìn)行定性鑒定及功能檢測。 方法:(1)取自然流產(chǎn)胎兒的股骨、脛骨等長骨骨髓,采用全骨髓培養(yǎng)法,按1x10~6/ml的密度接種至含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中,5%CO_2箱中孵育48h后換液,每3d換液1次,細(xì)胞貼壁生長呈成纖維樣,1:3傳代繼續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng),取3-8代MSCs予以2—巰基乙醇、EGF、bFGF、B27及尼克酰胺分三階段定向誘導(dǎo)分化為胰島樣細(xì)胞。(2)同時取胎兒胰腺體組織,機(jī)械破碎,膠原酶及胰酶消化,離心后將單細(xì)胞懸液種植于含10%FBS及1XB27的高糖DMEM培養(yǎng)基中,48h后培養(yǎng)液改換為含2%FBS及1XB27的DMEM-F12培養(yǎng)液,1:2消化傳代。觀察加ITS-A及EGF后細(xì)胞自發(fā)分化為神經(jīng)元及胰島樣結(jié)構(gòu),同時予以EGF、bFGF、B27及尼克酰胺分兩階段定向誘導(dǎo)分化。(3)取山東省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心自行建立的體細(xì)胞核移植胚胎干細(xì)胞系(SCNT-hES),采用六階段誘導(dǎo)分化:(一)用含15%FBS及2—巰基乙醇的高糖DMEM預(yù)分化3d;(二)用含15%FBS的高糖DMEM懸浮培養(yǎng)6d形成類胚體(EBs);(三)EBs加入含ITS-A和纖維結(jié)合素的DMEM-F12貼壁培養(yǎng)6d;(四)將細(xì)胞消化接種于含N2、B27及bFGF的DMEM-F12中擴(kuò)增胰前體細(xì)胞6d;(五)撤掉bFGF加入尼克酰胺促進(jìn)胰島細(xì)胞形成;(六)胰島細(xì)胞進(jìn)一步成熟。對三種不同來源的各期細(xì)胞分別進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、雙硫腙染色、免疫細(xì)胞組織化學(xué)及共聚焦顯微鏡免疫熒光鑒定nestin、PDX-1、insulin及glucagon的表達(dá),并用電化學(xué)發(fā)光法定量測定胰島素分泌量。 結(jié)果:(1)胎兒MSCs于接種后24h即可見到貼壁生長的成纖維樣細(xì)胞,8—9d達(dá)到80%融合,其后進(jìn)入對數(shù)生長期,細(xì)胞倍增時間為30h,誘導(dǎo)過程中細(xì)胞逐漸變圓,表達(dá)nestin、PDX-1、insulin和glucagon,雙硫腙染色見棕紅色細(xì)胞團(tuán),MSCs分化得到的胰島樣細(xì)胞胞漿胰島素分泌量為81.3±23.6uu/ml,有一定程度葡萄糖依賴性
[Abstract]:Objective: to provide the ideal seed cells for the treatment of diabetic cell replacement, and to induce differentiation into islet like cells of fetal bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs), fetal pancreatic stem cells (PSCs) and human autologous gene derived embryonic stem cells (SCNT-hESs), respectively. The temporal and spatial changes of differentiation cells and the expression of stage specific antigen were observed dynamically. The terminal differentiation cells were identified qualitatively and their functions were detected. Methods the bone marrow of femur and tibia of abortive fetus was taken. The bone marrow of femur and tibia was cultured by whole bone marrow culture method. The bone marrow was inoculated into the DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at the density of 1 x 10 / ml, and incubated in box 5CO 2 for 48 hours and then changed solution once every 3 days. The cells grew in fibroblast like 1: 3 and then expanded and cultured. The 3-8 passages of MSCs were treated with 2-mercaptoethanol, EGFbFGFB27 and nicotinamide in three stages to induce differentiation into islet like cells. Meanwhile, the fetal pancreatic tissue was extracted, and the tissue of fetal pancreas was mechanically broken. Collagenase and trypsin digestion, After centrifugation, the single cell suspension was planted in high sugar DMEM medium containing 10s and 1XB27 for 48 h. The culture medium was replaced with DMEM-F12 medium containing 2S and 1XB27 after 48 hours. The cells differentiated spontaneously into neurons and islet like structures after adding ITS-A and EGF. At the same time, EGFNbFGFB27 and nicotinamide were used to induce differentiation in two stages. (3) SCNT-hESN, a somatic cell nuclear transfer embryonic stem cell line established by Shandong Stem Cell Engineering Research Center, was obtained. Pre-differentiation of S and 2-mercaptoethanol with high sugar DMEM for 3 days (2) suspension culture of high sugar DMEM containing 15s for 6 days to form embryoid DMEM (3) EBs added with DMEM-F12 containing ITS-A and fibronectin for 6 days (4) cells digested and inoculated with N2B27 and bFGF. (5) removing bFGF and adding nicotinamide to promote the further maturation of islet cells. Dithizone staining, immunohistochemistry and confocal microscopy immunofluorescence were used to detect the expression of PDX-1 insulin and glucagon in Neisin, and the amount of insulin secretion was measured by electrochemiluminescence. Results Fetal MSCs could reach 80% fusion at 8-9 days after inoculation, then entered logarithmic growth period, the cell doubling time was 30h, and the cells became round during induction. The expression of PDX-1insulin and glucagon.Dithizone staining showed that the cytoplasmic insulin secretion of islet like cells was 81.3 鹵23.6uU / ml, which was dependent on glucose to some extent.
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號】：R329.2

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 汪維偉;王蓓;張建華;姜蓉;;胎兒腸壁結(jié)締組織誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為上皮細(xì)胞(英文)[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2008年25期

2 楊艷;段征;姜蓉;汪維偉;;三種結(jié)締組織體外誘導(dǎo)胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2008年06期

3 田靜;王蓓;張建華;姜蓉;汪維偉;;胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特征及熒光標(biāo)記[J];重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2008年06期

4 張燕,劉杰,王德文,崔雪梅,谷慶陽,董波,趙梅蘭;胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及表面標(biāo)志的檢測[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2002年06期

5 張斌;劉瑞;朱希山;豆曉偉;劉星霞;陳媛;趙春華;;成骨誘導(dǎo)或干擾素γ預(yù)處理對胎兒骨髓源Flk-1~+間充質(zhì)干細(xì)胞免疫活性的調(diào)節(jié)[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2008年43期

6 段江潔重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與組織工程研究室,組織胚胎學(xué)教研室;王蓓重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與組織工程研究室,組織胚胎學(xué)教研室;張建華;姜蓉重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與組織工程研究室,組織胚胎學(xué)教研室;汪維偉重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與組織工程研究室,組織胚胎學(xué)教研室;;胎兒腸壁結(jié)締組織誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向腸上皮細(xì)胞的分化[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2008年18期

7 楊艷;段征;姜蓉;汪維偉;;表皮生長因子、胰島素樣生長因子-1體外誘導(dǎo)胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化[J];解剖學(xué)雜志;2008年05期

8 劉斌;戎利民;董健文;曾春;蔡道章;;密度梯度離心與貼壁篩選法體外分離培養(yǎng)胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2009年40期

9 方利君;付小兵;程飚;孫同柱;李建福;曹榮;王玉新;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與皮脂腺導(dǎo)管構(gòu)成的初步研究[J];感染.炎癥.修復(fù);2003年04期

10 付小兵,方利君,王玉新,孫同柱,程飚;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自體移植提高豬皮膚創(chuàng)面修復(fù)質(zhì)量的初步研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2004年11期

相關(guān)會議論文 前10條

1 郭虹;劉杰文;楊少光;曹德駿;劉津華;廖聯(lián)明;趙春華;;具有間充質(zhì)干細(xì)胞特征的CD_(105)~+細(xì)胞在胎兒多種組織器官的分布[A];第九屆全國實驗血液學(xué)會議論文摘要匯編[C];2003年

2 趙勝;陳欣林;楊小紅;;胎兒尿道下裂的超聲診斷及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)[A];中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第三屆全國婦產(chǎn)及計劃生育超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

3 黃曉微;常才;;三維超聲評價胎兒小腦體積[A];2005年上海市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會學(xué)術(shù)年會論文集[C];2005年

4 吳瑛;劉士龍;倪志鵬;劉濤;熊奕;李劍;;時空關(guān)聯(lián)成像技術(shù)對胎兒室間隔缺損的應(yīng)用研究[A];第十屆全國超聲心動圖學(xué)術(shù)會議論文[C];2010年

5 張忠和;劉樹偉;林祥濤;孫博;于臺飛;耿鶴群;;胎兒大腦皮質(zhì)折疊的MRI研究[A];中國解剖學(xué)會2011年年會論文文摘匯編[C];2011年

6 何吉;朱發(fā)明;洪小珍;劉晉輝;陳舒;秦斐;嚴(yán)力行;;從孕婦血漿中提取胎兒DNA鑒定胎兒RhCcEe血型[A];中國輸血協(xié)會第三屆輸血大會論文專輯[C];2004年

7 展新風(fēng);劉韶平;傅慶昭;陶國偉;程琳;;應(yīng)用超聲評分法對胎兒腎積水的可復(fù)性研究[A];第二屆超聲診斷安全閾值及胎兒畸形研討會論文匯編[C];2005年

8 秦平;馬小卿;謝玉嫻;;超聲對胎兒腎盂積水的觀察及其臨床意義[A];第一屆全國婦產(chǎn)科超聲學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

9 梁洋;楊瑩;毛巍巍;安鐵洙;;4℃下保存的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物解剖學(xué)及組織胚胎學(xué)分會第十四次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2006年

10 朱少毅;蟻麗芬;王漢嬋;;抗精神病藥物對胎兒影響的臨床研究[A];中國民康醫(yī)學(xué)雜志創(chuàng)刊20周年優(yōu)秀論文集（1988-2008）[C];2008年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 王瑩;懷孕“早早期” 用藥需謹(jǐn)慎[N];健康時報;2006年

2 記者 劉熙;我省綜治出生人口性別比失衡問題[N];云南日報;2005年

3 張 華;音樂胎教四誤區(qū)[N];中國中醫(yī)藥報;2006年

4 周紅;北大研究發(fā)現(xiàn)H5N1病毒可感染胎兒[N];中國醫(yī)藥報;2007年

5 吳m#麓;胎兒寫真安全嗎[N];北京科技報;2008年

6 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院感染病科 劉征波 博士;夫妻患乙肝胎兒受影響[N];大眾衛(wèi)生報;2005年

7 南羽;一案三嘆[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2010年

8 健康時報特約記者　　李春梅;準(zhǔn)媽媽準(zhǔn)爸爸：惡吵會傷胎兒大腦[N];健康時報;2006年

9 ;懷孕中期慎用西藥[N];農(nóng)村醫(yī)藥報（漢）;2008年

10 羅照春;預(yù)防糖尿病應(yīng)從胎兒抓起[N];中國醫(yī)藥報;2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 李海生;低氧促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化及其機(jī)制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2005年

2 史達(dá);木豆葉聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療股骨頭壞死的實驗與相關(guān)臨床研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2007年

3 顧紹峰;兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為角膜上皮樣細(xì)胞的體外研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2008年

4 張偉;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2004年

5 張海峰;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠急性肝功能衰竭治療作用的實驗研究[D];山東大學(xué);2007年

6 牟大鵬;抑制消減雜交技術(shù)篩選骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化前后差異表達(dá)基因[D];吉林大學(xué);2007年

7 景紅;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為腎臟系膜細(xì)胞樣細(xì)胞的實驗研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

8 宋可新;黑色素細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合構(gòu)建組織工程皮膚的初步研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

9 滕春燕;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對急性胰腺炎損傷修復(fù)及其機(jī)制的實驗研究[D];吉林大學(xué);2009年

10 任曉勇;人生長分化因子-5基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及用于軟骨缺損修復(fù)的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 段江潔;EGF-R、IGF-1-R在胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分化為上皮細(xì)胞中的作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2009年

2 陳書尚;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療心力衰竭的實驗研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2005年

3 劉宏志;大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)前體細(xì)胞的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2005年

4 王艷芳;生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[D];大連理工大學(xué);2006年

5 陳潔;同種異體移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠心梗后心室重構(gòu)[D];浙江大學(xué);2006年

6 劉弘光;嘗試移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠糖尿病[D];中國醫(yī)科大學(xué);2006年

7 董玉泉;兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及生物學(xué)特性研究[D];青島大學(xué);2006年

8 項正兵;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元樣細(xì)胞定向分化的實驗研究[D];南昌大學(xué);2007年

9 周哲;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞bFGF復(fù)合降解膜修復(fù)皮膚缺損的研究[D];吉林大學(xué);2008年

10 賈小力;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈移植對損傷大鼠脊髓VEGF、bFGF表達(dá)及血管新生的影響[D];福建醫(yī)科大學(xué);2008年

，

本文編號：1604061