本文選題：精氨酸脫酰酶　切入點：克隆　出處：《中國醫(yī)科大學》2007年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 目的 合成編碼支原體精氨酸脫酰酶(Arginine Deiminase，ADI)的基因，構建原核表達載體，獲得高水平表達支原體精氨酸脫酰酶的工程化菌種；探索用聚乙二醇修飾支原體精氨酸脫酰酶的反應條件，建立PEG化支原體精氨酸脫酰酶(PEG-ADI)的制備工藝；探索修飾混合物的分離純化工藝，獲得PEG-ADI純品；建立活性測定方法，并研究修飾物活性。 方法 采用化學合成方法和DNA聚合酶鏈式反應(PCR)合成編碼支原體精氨酸脫酰酶的基因。采用pBV220質(zhì)粒構建原核表達載體，轉化大腸桿菌DH5α，篩選氨芐青霉素抗性克隆。采用5升發(fā)酵系統(tǒng)進行發(fā)酵研究。采用分子量20kD的聚乙二醇修飾精氨酸脫酰酶。探索溫度、攪拌、反應時間等因素對反應效率的影響。采用凝膠層析等方法對修飾產(chǎn)物進行分離純化。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白質(zhì)分子量；采用C18反向高效液相色譜分析修飾產(chǎn)物純度；采用體外精氨酸降解方法研究修飾產(chǎn)物的活性。 結果 我們獲得了編碼支原體精氨酸脫酰酶的全長DNA，成功構建了原核表達載體pBV220-ADI，獲得了表達支原體精氨酸脫酰酶的大腸桿菌菌種，，目標蛋白表達量占全菌蛋白的30％以上；表達產(chǎn)物主要以包含體形式存在；發(fā)酵實驗表明工程菌能夠大規(guī)模制備，表達穩(wěn)定；建立了聚乙二醇修飾精氨酸脫酰酶的化學反應工藝；建立了修飾產(chǎn)物的分離純化工藝。通過二次凝膠排阻層析方法可以充分分離單一修飾產(chǎn)物，獲得了單修飾產(chǎn)物純品；成功建立了精氨酸降解法來測定產(chǎn)物活性的質(zhì)量控制方法，未修飾ADI與PEG-ADI的比活性分別為40IU/mg和30IU/mg；聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測ADI和PEG-ADI的分子量分別約為45kD和65kD；高效液相檢測結果顯示PEG-ADI純度大于95％。 結論 本研究通過原核表達系統(tǒng)獲得了支原體精氨酸脫酰酶的高效表達。表達產(chǎn)物以包含體形式存在于細胞質(zhì)內(nèi)。小試發(fā)酵表明該菌種可以進行放大生產(chǎn)，這為繼續(xù)進行ADI深層次研究奠定了基礎；建立了優(yōu)化的聚乙二醇修飾精氨酸脫酰酶的反應條件，明確了最佳反應參數(shù)，為大規(guī)模制備PEG-ADI提供了前提；研究還建立了簡便、高效的反應混合物分離純化工藝路線，為聚乙二醇修飾物的制備提供了堅實的下游工程技術保障；研究還建立了采用體外精氨酸降解法來測定產(chǎn)物活性的質(zhì)量控制方法，為該活性物的深入研究提供了方便的檢測和控制手段。本研究為肝癌治療提供了一個新的活性物質(zhì)，具有重要的學術意義和臨床應用價值。
[Abstract]:Purpose. The gene encoding arginine deacylase (Arginine Deiminase) was synthesized, the prokaryotic expression vector was constructed, the engineering strain expressing arginine deacylase with high level was obtained, and the reaction conditions for modification of arginine deacylase by polyethylene glycol were explored. To establish the preparation process of PEG arginine deacylase (PEG-ADI); to explore the separation and purification of modified mixture to obtain pure PEG-ADI; to establish a method for the determination of activity; and to study the activity of the modified compound. Method. The gene encoding arginine deacylase of mycoplasma was synthesized by chemical synthesis and DNA polymerase chain reaction. The prokaryotic expression vector was constructed by using pBV220 plasmid. Transformation of Escherichia coli DH5 偽, screening of ampicillin resistant clones. Fermentation of ampicillin by 5 liter fermentation system. 20kD polyethylene glycol modified arginine deacylase. The effect of reaction time and other factors on the reaction efficiency. The modified product was separated and purified by gel chromatography. The molecular weight of the modified product was detected by polyacrylamide gel electrophoresis, and the purity of the modified product was analyzed by C18 reverse high performance liquid chromatography. The activity of the modified product was studied by arginine degradation in vitro. Results. The full-length DNA encoding mycoplasma arginine deacylase was obtained, and the prokaryotic expression vector pBV220-ADIwas constructed successfully. The E. coli strain expressing mycoplasma arginine deacylase was obtained, and the target protein expression amount was more than 30% of the whole bacterial protein. The expression products mainly existed in the form of inclusions, the fermentation experiments showed that the engineering bacteria could be prepared on a large scale and expressed stably, and the chemical reaction process of polyethylene glycol modified arginine deacylase was established. The purification process of the modified product was established. The single modified product could be fully separated by secondary gel exclusion chromatography, and the pure product of the single modified product could be obtained, and the arginine degradation method was successfully established to determine the quality control method for the activity of the product. The specific activities of unmodified ADI and PEG-ADI were 40 渭 / mg and 30 渭 / mg respectively, the molecular weight of ADI and PEG-ADI by polyacrylamide gel electrophoresis were about 45kD and 65kDrespectively, and the purity of PEG-ADI was higher than 95kD by HPLC. Conclusion. In this study, a prokaryotic expression system was used to obtain the high expression of arginine deacylase from mycoplasma. The expressed product existed in the cytoplasm in the form of inclusion body. The small scale fermentation showed that the strain could be amplified to produce mycoplasma arginine deacylase. This laid a foundation for the further study of ADI, established the optimized reaction conditions of polyethylene glycol modified arginine deacylase, determined the optimum reaction parameters, provided the premise for the large-scale preparation of PEG-ADI, and established a simple and convenient method for the preparation of PEG-ADI. The efficient separation and purification process of reaction mixture provides a solid downstream engineering guarantee for the preparation of polyethylene glycol modifiers, and also establishes a quality control method for the determination of product activity by in vitro arginine degradation method. This study provides a new active substance for the treatment of liver cancer and has important academic significance and clinical application value.
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R341

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