本文選題：PTEN　切入點：活性氧　出處：《青島大學》2006年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：Pten作為第一個被發(fā)現(xiàn)的具有磷酸酶功能的抑癌基因,在多種腫瘤中存在高頻率缺失或突變。據(jù)估計,總體突變率相當于著名的腫瘤抑制基因p53,是目前腫瘤研究的熱點基因之一。 培育基因敲除小鼠是深入研究基因功能的最重要手段之一,先后有四家實驗室成功培育了Pten的基因敲除小鼠。MEF1/Pten~(-/-)和MEF2/Pten~(-/-)是由Hong wu博士的實驗室建立的PTEN缺失的胚胎成纖維細胞株,是由原代培養(yǎng)的PTEN基因敲除小鼠的胚胎成纖維細胞永生化而來,我們以此為試驗模型開展研究。 為了研究PTEN調(diào)控細胞各項生命活動的新機制,第一階段:我們采用蛋白質組學技術來進行蛋白篩選,首先通過雙向電泳技術,比較了PTEN缺失的胚胎成纖維細胞與正常胚胎成纖維細胞蛋白表達譜,發(fā)現(xiàn)在兩株不同的PTEN缺失的胚胎成纖維細胞中有明顯表達差異的蛋白,隨后利用質譜技術鑒定及生物信息學檢索分析,找出在Pten基因敲除小鼠的胚胎成纖維細胞中,抗氧化酶Cu/Zn-SOD、PeroxiredoxinⅤ-Ⅵ,細胞遷移相關蛋白Cofilin 1、GDI2,其他如LMW-PTP、Tagln 2等十多個表達差異蛋白;第二階段:對篩選出的差異表達蛋白進一步進行分子生物學技術鑒定,并對部分蛋白進行了相應的生物學活性檢測。在此研究中,我們主要采用MEF2/Pten~(-/-)細胞系作為試驗對象,對MEF1/Pten~(-/-)細胞系的蛋白質組學結果只作為參照研究,結果如下: 1.在Pten基因敲除小鼠的胚胎成纖維細胞中,Northern blot及Western blot結果顯示:Cu/Zn-SOD在mRNA及蛋白質表達水平均高于正常胚胎成纖維細胞,而且酶活性也明顯增強;以流式細胞儀進行熒光探針標記活性氧檢測發(fā)現(xiàn):細胞中O_2含量明顯增加。提示Pten基因敲除后,細胞內(nèi)發(fā)生了氧化應激反應,O_2的增加及AKT信號的增強刺激了Cu/zn-SOD的表達。 2.在Pten基因敲除小鼠細胞中,通過Northern blot及Western blot檢測,結果顯示:在PRX家族中,PRX Ⅰ-Ⅴ在mRNA及蛋白質水平均高表達,但只有PRX Ⅵ低表達。流式細胞儀檢測細胞內(nèi)H_2O_2含量明顯下降,在給予0.5mM H_2O_2刺激后,細胞內(nèi)H_2O_2水平發(fā)生了翻轉,明顯高于對照細胞,而正常對照細胞中變化不明顯。結果提示在Pten敲除細胞中,氧化與抗氧化平衡已被破壞,細胞內(nèi)PRX家族在清除H_2O_2方面可能發(fā)生了重要作用。在Pten基因與氧化劑之間、SOD與PRX Ⅵ之間可能存在著負調(diào)控。 3.Pten基因敲除后,Northern blot及RT-PCR結果顯示,細胞中遷移相關蛋白Cofilin 1表達上調(diào),而GDI2顯示下調(diào),符合惡性腫瘤的轉移表型。 4.其他蛋白:LMW-PTP,Tagln2 mRNA低表達,與細胞生長、增殖的信號轉導有關。 通過本研究我們發(fā)現(xiàn),Pten基因敲除后,細胞內(nèi)發(fā)生了氧化應激反應,原有的氧化與抗氧化平衡失調(diào),總體抗氧化能力下降,抗氧化酶Cu/zn-SOD和PRX的表達也產(chǎn)生了適應性調(diào)整,氧化劑與PTEN之間可能存在著負調(diào)控,并有AKT信號通路的參與。檢測出的其它幾種蛋白狀
[Abstract]:......
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R-332

【共引文獻】

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本文編號：1584451