本文選題：肝素酶　切入點(diǎn)：樹突狀細(xì)胞　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： [背景和目的] 生物治療是繼手術(shù)、放療和化療之后臨床治療惡性腫瘤的第四種治療模式。隨著對(duì)機(jī)體抗腫瘤免疫機(jī)制的深入研究，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到誘發(fā)體內(nèi)細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(Cytotic T Lymphocyte，CTL)發(fā)揮抗瘤作用的并不是整個(gè)腫瘤抗原分子，而是與MHC分子結(jié)合的短肽即CTL表位(epitopes)，因此，尋找特異性腫瘤抗原及其相應(yīng)的CTL表位成為腫瘤免疫治療的關(guān)鍵。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DC)作為體內(nèi)最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，是免疫應(yīng)答過程的始動(dòng)者和調(diào)節(jié)者。負(fù)載CTL表位的DC疫苗因其免疫原性好、副作用小、便于應(yīng)用等優(yōu)勢(shì)而成為目前抗腫瘤治療研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 肝素酶(Heparanase，Hpa)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，在正常組織中僅低表達(dá)于淋巴細(xì)胞和骨髓等免疫組織，但在幾乎所有的轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤細(xì)胞中普遍存在，而且表達(dá)的水平與腫瘤的轉(zhuǎn)移、TMN分期等臨床預(yù)后不良指標(biāo)明顯相關(guān)，肝素酶已成為中晚期腫瘤治療的一個(gè)良好靶位。那么肝素酶能否作為一種腫瘤相關(guān)抗原用于腫瘤的免疫治療?我們過去的研究表明，肝素酶全長(zhǎng)基因負(fù)載的DC體外可以誘導(dǎo)肝素酶特異性CTL，對(duì)肝素酶陽(yáng)性且MHC相匹配的胃癌細(xì)胞具有殺傷作用，而對(duì)肝素酶陽(yáng)性但MHC不相匹配的胃癌細(xì)胞不具有殺傷效應(yīng)，提示肝素酶氨基酸全長(zhǎng)序列中一定存在能誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)的抗原表位。 本研究的目的在于尋找存在于肝素酶全長(zhǎng)序列中的能夠有效激發(fā)機(jī)體抗腫瘤效應(yīng)的CTL表位。鑒于HLA-A2．1是中國(guó)人群中最為常見的HLAⅠ類分子的型別，陽(yáng)性率高達(dá)50％，因此鑒定腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)抗原Hpa的HLA-A2．1限制性CTL表位將會(huì)對(duì)中國(guó)人群中肝素酶表達(dá)陽(yáng)性的惡性腫瘤提供免疫治療的基礎(chǔ)。 [方法] 1、采用超基序和量化基序相結(jié)合的方法對(duì)肝素酶的HLA-A2．1限制性CTL表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，并用分子模擬技術(shù)模擬表位肽與MHC分子結(jié)合的空間構(gòu)象，分析結(jié)合參數(shù)以進(jìn)一步提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，然后從結(jié)果中選取得分較高的5條肝素酶表位肽進(jìn)行合成、純化、分子量鑒定，利用T_2細(xì)胞的特點(diǎn)對(duì)合成的候選肽與HLA-A2．1分子的進(jìn)行親和力分析；采用標(biāo)準(zhǔn)~(51)Cr釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上述肝素酶表位肽負(fù)載DC后誘導(dǎo)的肝素酶特異性CTL對(duì)KATO-Ⅲ胃癌細(xì)胞的免疫殺傷效應(yīng)，從而篩選出能夠有效激活CTL反應(yīng)的肝素酶抗原表位。 2、采用密度梯度離心法分離并得到人外周血單個(gè)核細(xì)胞，利用rhGM-CSF、rhIL-4及rhTNF-α誘導(dǎo)擴(kuò)增人成熟樹突狀細(xì)胞，并從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面CD分子進(jìn)行鑒定；用上述篩選的候選肽負(fù)載DC誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性CTL，采用標(biāo)準(zhǔn)~(51)Cr釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝素酶特異性CTL對(duì)KATO-Ⅲ胃癌細(xì)胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)、U-2OS骨肉瘤細(xì)胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)、SW480結(jié)腸癌細(xì)胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)、MCF-7乳腺癌細(xì)胞(Hpa~-，HLA-A2．1~+)、HepG2肝癌細(xì)胞(Hpa~+，HLA-A2．1~-)以及轉(zhuǎn)染了肝素酶全長(zhǎng)基因的MCF-7／Hpa乳腺癌細(xì)胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)和轉(zhuǎn)染了HLA-A2．1基因的HepG2／HLA-A2．1肝癌細(xì)胞(Hpa~+，HLA-A2．1~+)的免疫殺傷效應(yīng)；采用HLA-A2．1單克隆抗體封閉上述靶細(xì)胞的HLA-A2．1位點(diǎn)，或以CD8單克隆抗體封閉效應(yīng)細(xì)胞的CD8位點(diǎn)，再用肝素酶表位特異性CTL殺傷KATO-Ⅲ胃癌細(xì)胞，以研究篩選的肝素酶表位是否受HLA-A2．1限制以及CTL效應(yīng)細(xì)胞的來源；采用標(biāo)準(zhǔn)~(51)Cr釋放實(shí)驗(yàn)研究肝素酶特異性CTL對(duì)自體淋巴細(xì)胞的免疫殺傷活性，以確定其可能存在的毒副作用；采用ELISPOT技術(shù)檢測(cè)肝素酶特異的效應(yīng)細(xì)胞IFN-γ釋放情況。 3、將上述篩選的肝素酶候選表位負(fù)載C57BL／6-Tg(HLA-A2．1)1Enge／J小鼠骨髓來源的DC(mDC)后，免疫小鼠三次，取其脾淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，采用~(51)Cr釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝素酶特異性CTL對(duì)KATO-Ⅲ、U2OS、SW480、MCF-7、MCF-7／Hpa、HepG2、HepG2／HLA-A2．1細(xì)胞以及自體淋巴細(xì)胞和mDC的殺傷效應(yīng)；ELISPOT技術(shù)檢測(cè)肝素酶特異的效應(yīng)細(xì)胞IFN-γ釋放情況。 [結(jié)果] 1、采用超基序和量化基序方法聯(lián)合預(yù)測(cè)出5條得分最高肝素酶表位肽：Hpa(525-533)(PAFSYSFFV)、Hpa(353-361)(PLLSDTFAA)、Hpa(277-285)(KMLKSFLKA)、Hpa(400-408)(PLPDYWLSL)、Hpa(405-413)(WLSLLFKKL)；T_2細(xì)胞親和力分析發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的5條多肽均能與T_2細(xì)胞有效結(jié)合；采用標(biāo)準(zhǔn)~(51)Cr釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)上述肝素酶表位肽負(fù)載DC后誘導(dǎo)的肝素酶特異性CTL對(duì)KATO-Ⅲ胃癌細(xì)胞的免疫殺傷效應(yīng)，結(jié)果表明，Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)誘導(dǎo)的CTL對(duì)KATO-Ⅲ胃癌細(xì)胞具有明顯的殺傷效應(yīng)，而Hpa(353-361)和Hpa(400-408)誘導(dǎo)的CTL對(duì)KATO-Ⅲ胃癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)與陰性肽相同，提示Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)可能是肝素酶特異性抗原表位。 2、采用密度梯度離心法分離HLA-A2．1陽(yáng)性健康志愿者外周血中的單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用重組人細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4及TNF-α聯(lián)合誘導(dǎo)擴(kuò)增，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察以及采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞表面CD分子進(jìn)行鑒定，成功制備了PBMC來源的成熟DC；采用標(biāo)準(zhǔn)~(51)Cr釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)表位負(fù)載DC后誘導(dǎo)的肝素酶特異性CTL對(duì)不同來源腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷效應(yīng)，結(jié)果表明，肝素酶特異性CTL對(duì)肝素酶陽(yáng)性且HLA-A2．1陽(yáng)性的KATO-Ⅲ、U2OS和SW480細(xì)胞具有明顯的殺傷效應(yīng)，而對(duì)肝素酶陰性但HLA-A2．1陽(yáng)性的MCF-7細(xì)胞和肝素酶陽(yáng)性但HLA-A2．1陰性的HepG2細(xì)胞均不具有殺傷效應(yīng)，但對(duì)轉(zhuǎn)染了肝素酶全長(zhǎng)基因的MCF-7細(xì)胞(MCF-7／Hpa)和轉(zhuǎn)染了HLA-A2．1全長(zhǎng)基因的HepG2細(xì)胞(HepG2／HLA-A2．1)重新產(chǎn)生明顯的免疫殺傷效應(yīng)，，提示肝素酶抗原表位誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)是肝素酶特異、且受HLA-A2．1限制；用HLA-A2．1和CD8分子的單抗分別封閉靶細(xì)胞表面的HLA-A2．1位點(diǎn)和效應(yīng)細(xì)胞表面的CD分子后再進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明肝素酶特異性CTL對(duì)封閉了HLA-A2．1的KATO-Ⅲ細(xì)胞無明顯殺傷效應(yīng)，封閉了CD8的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)KATO-Ⅲ細(xì)胞亦無明顯殺傷效應(yīng)，進(jìn)一步提示這種殺傷效應(yīng)是HLA-A2．1限制，CTL效應(yīng)細(xì)胞來源于CD8陽(yáng)性的T淋巴細(xì)胞；采用標(biāo)準(zhǔn)~(51)Cr釋放實(shí)驗(yàn)驗(yàn)檢測(cè)上述肝素酶抗原表位誘導(dǎo)的肝素酶特異性CTL對(duì)自體淋巴細(xì)胞的免疫殺傷效應(yīng)，結(jié)果表明肝素酶特異性CTL對(duì)自體淋巴細(xì)胞無明顯殺傷效應(yīng)，提示肝素酶多肽疫苗的安全性(表1)；采用ELISPOT技術(shù)檢測(cè)肝素酶特異性效應(yīng)細(xì)胞IFN-γ的分泌能力，結(jié)果表明，肝素酶抗原表位能促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞IFN-γ的分泌。 3、用上述肝素酶表位肽負(fù)載C57BL／6-Tg(HLA-A2．1)1Enge／J小鼠骨髓來源的DC(mDC)，然后免疫小鼠三次，取其脾淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，以不同來源的多種腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞，用~(51)Cr釋放法檢測(cè)殺傷效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肝素酶表位特異性的CTL對(duì)肝素酶陽(yáng)性且HLA-2陽(yáng)性的KATO-Ⅲ、U2OS和SW480細(xì)胞具有明顯的殺傷效應(yīng)，而對(duì)肝素酶陰性但HLA-A2．1陽(yáng)性的MCF-7細(xì)胞和肝素酶陽(yáng)性但HLA-A2．1陰性的HepG2細(xì)胞均不具有殺傷效應(yīng)，但對(duì)感染了肝素酶全長(zhǎng)基因的重組腺病毒(rAd-Hpa)的MCF-7乳腺癌細(xì)胞(MCF-7／rAd-Hpa)和轉(zhuǎn)染HLA-A2．1的HepG2／HLA-A2．1細(xì)胞亦重新產(chǎn)生明顯的殺傷效應(yīng)，對(duì)自體淋巴細(xì)胞和mDC亦無明顯殺傷效應(yīng)(表1)。ELISPOT技術(shù)檢測(cè)肝素酶抗原表位能有效促進(jìn)肝素酶特異性效應(yīng)細(xì)胞分泌IFN-γ。 [結(jié)論] 1、采用超基序和量化基序法并通過體外殺傷實(shí)驗(yàn)從肝素酶的全長(zhǎng)氨基酸序列中篩選出了3條HLA-A2．1限制的CTL表位，即Hpa(525-533)(PAFSYSFFV)、Hpa(277-285)(KMLKSFLKA)、Hpa(405-413)(WLSLLFKKL)，以上肝素酶抗原表位與德國(guó)學(xué)者的報(bào)道不同。 2、從體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)二方面證實(shí)肝素酶抗原表位Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生肝素酶特異性CTL，對(duì)肝素酶陽(yáng)性且HLA-A2．1相匹配的腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的免疫殺傷活性，對(duì)肝素酶陰性或HLA-A2．1陰性的腫瘤細(xì)胞不具有殺傷效應(yīng)，但對(duì)轉(zhuǎn)染了肝素酶或HLA-A2．1的腫瘤細(xì)胞具有殺傷效應(yīng)，提示肝素酶抗原表位誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)是肝素酶特異且受HLA-A2．1限制，肝素酶特異性CTL主要來源于CD8陽(yáng)性T淋巴細(xì)胞。 3、從體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)二方面證實(shí)肝素酶特異性CTL對(duì)自體淋巴細(xì)胞和／或DC無明顯的免疫殺傷活性，提示肝素酶多肽疫苗臨床應(yīng)用的安全性。 4、從體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)二方面證實(shí)肝素酶抗原表位Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)負(fù)載的DC可以促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞IFN-γ釋放。 以上研究表明，人肝素酶特異性抗原表位[Hpa(525-533)、Hpa(277-285)、Hpa(405-413)]不僅能激發(fā)機(jī)體特異性的抗腫瘤效應(yīng)，而且還能誘導(dǎo)一個(gè)非特異性抗腫瘤的良性循環(huán)，這種肝素酶多肽疫苗具有廣譜、高效、特異、安全的優(yōu)點(diǎn)，為肝素酶表位多肽疫苗的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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7 江繼發(fā),魏海明;檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移指標(biāo)的臨床意義[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(腫瘤學(xué)分冊(cè));1998年02期

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10 周光炎，范麗安;HLA：新的進(jìn)展和新的起點(diǎn)──記第12屆國(guó)際組織相容性會(huì)議[J];上海免疫學(xué)雜志;1996年06期

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本文編號(hào)：1579656