發(fā)布時(shí)間：2018-03-05 04:17

  本文選題：M-CSF　切入點(diǎn)：NIH　出處：《南華大學(xué)》2006年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：建立胞質(zhì)內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)M-CSF的細(xì)胞系；探討定位在胞質(zhì)內(nèi)的M-CSF對(duì)細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)的影響。 方法：PCR分別擴(kuò)增人M-CSF的胞外活性區(qū)和功能區(qū)，連接到胞漿定位載體pCMV／cyto／myc質(zhì)粒，，得重組質(zhì)粒pCMV／cyto／myc-h-M-CSF，再將重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NIH 3T3細(xì)胞，得到分別穩(wěn)定表達(dá)M-CSF的胞外活性區(qū)和功能區(qū)的細(xì)胞株。免疫細(xì)胞化學(xué)驗(yàn)證M-CSF蛋白的定位，細(xì)胞生長曲線和致傷愈合實(shí)驗(yàn)顯示外源的M-CSF對(duì)NIH3T3細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)的影響。考馬斯亮蘭對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行染色。 結(jié)果：重組基因的插入片段大小分別與M-CSF的胞外區(qū)和功能區(qū)相符，重組的M-CSF片段無閱讀框移位和突變，綠色熒光蛋白僅定位在NIH3T3細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，表明成功構(gòu)建胞漿定位表達(dá)載體pCMV／cyto／myc-M-CSF-a和pCMV／cyto／myc-M-CSF-d；分別將pCMV／cyto／myc-M-CSF-a和pCMV／cyto／myc-M-CSF-d質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，并經(jīng)G418篩選后，穩(wěn)定表達(dá)M-CSF胞外區(qū)和功能區(qū)的NIH 3T3細(xì)胞株其倍增時(shí)間均短于對(duì)照細(xì)胞；胞質(zhì)內(nèi)M-CSF誘導(dǎo)NIH3T3細(xì)胞微絲重構(gòu)和細(xì)胞遷移；M-CSF N末端149個(gè)氨基酸殘基組成的功能區(qū)其促NIH3T3細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)活性與M-CSF的胞外區(qū)基本相同。 結(jié)論：建立了一個(gè)細(xì)胞質(zhì)穩(wěn)定表達(dá)M-CSF的細(xì)胞系；細(xì)胞質(zhì)M-CSF能誘導(dǎo)NIH 3T3細(xì)胞增殖，增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力；M-CSF蛋白的功能區(qū)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖與遷移的生物學(xué)活性與M-CSF胞外區(qū)的活性基本相同。
[Abstract]:Aim: to establish a cell line with stable expression of M-CSF in cytoplasm and to investigate the effect of M-CSF localized in cytoplasm on cell proliferation and motility. Methods the extracellular active and functional regions of human M-CSF were amplified by 10: PCR and ligated to the plasmids of cytoplasmic localization vector pCMV/cyto/myc. The recombinant plasmid pCMV / cyto- myc-h-M-CSF was then stably transfected into NIH. 3T3 cell lines expressing the extracellular active and functional regions of M-CSF were obtained, respectively. The localization of M-CSF protein was confirmed by immunocytochemistry. The cell growth curve and wound healing test showed that exogenous M-CSF had an effect on the proliferation and movement of NIH3T3 cells. Coomassie brilliant blue stained the cytoskeleton. Results: the insert size of the recombinant gene was consistent with the extracellular and functional regions of M-CSF respectively. The recombinant M-CSF fragment had no reading frame translocation or mutation, and the green fluorescent protein was located only in the cytoplasm of NIH3T3. The results showed that the cytoplasmic localization expression vectors pCMV/cyto/myc-M-CSF-a and pCMVr-myc-M-CSF-dwere successfully constructed, and the pCMV/cyto/myc-M-CSF-a and pCMV/cyto/myc-M-CSF-d plasmids were transfected into NIH3T3 cells respectively. After G418 screening, the doubling time of NIH3T3 cells expressing the extracellular and functional regions of M-CSF was shorter than that of the control cells. Cytoplasmic M-CSF induces NIH3T3 cell microfilament remodeling and cell migration. The functional region composed of 149 amino acid residues at the N-terminal of M-CSF can promote the proliferation and motor activity of NIH3T3 cells, which is basically the same as the extracellular domain of M-CSF. Conclusion: a cell line with stable expression of M-CSF in cytoplasm was established, and cytoplasm M-CSF could induce the proliferation of NIH 3T3 cells. The biological activity of cell proliferation and migration induced by the functional region of M-CSF protein was basically the same as that of the extracellular domain of M-CSF.
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：1568709