本文關(guān)鍵詞： 脂肪組織 干細(xì)胞 培養(yǎng) 組織工程 人類 磷脂酰膽堿 脂肪細(xì)胞 脂肪溶解 肥胖癥　出處：《第一軍醫(yī)大學(xué)》2006年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 一、自人體脂肪組織分離與培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 研究背景：種子細(xì)胞是組織工程化組織能夠再生的首要物質(zhì)基礎(chǔ)。干細(xì)胞由于其體外高增殖率和多向分化潛能成為種子細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。近年來，研究顯示脂肪基質(zhì)細(xì)胞中存在著一定量的干細(xì)胞(稱為脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，AMSCs)，在一定條件下可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞方向分化。雖然對AMSCs的初步研究有一定的成果，但是其中仍有許多問題有待闡明。如脂肪組織中是否真正存在一類干細(xì)胞，這類干細(xì)胞是否是周圍血中MSCs透過血液向脂肪組織中的滲透。如何在體外構(gòu)建一種簡單、經(jīng)濟(jì)、易推廣的培養(yǎng)方法。分化后的細(xì)胞是否來源AMSCs，以及AMSCs的免疫性如何等都是有待探討的地方。 目的：探索人脂肪組織源性間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSCs)的分離、體外培養(yǎng)方法，以及生物學(xué)特性，為其廣泛應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：無菌條件下獲取腹部手術(shù)病人皮下脂肪組織，酶消化法分離、培養(yǎng)AMSCs，觀察細(xì)胞形態(tài)并繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間。對第2代細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，鑒定其表面分子CD44表達(dá)。取2～4代細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清，1％青鏈霉素原液，1μmol／L地塞米松，10μmol／L胰島素，0.5mmol／LIBMX的高糖DMEM培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)兩周，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并用油紅“O”染色定性。 結(jié)果：人脂肪組織中含有大量間充質(zhì)干細(xì)胞，接種后細(xì)胞在24小時(shí)內(nèi)貼壁，初為小圓形，2～4天可見細(xì)胞伸展，大多數(shù)細(xì)胞為長梭形，呈成纖維細(xì)胞樣貼壁生長，其間也可見形態(tài)、體積不一的多種細(xì)胞成分。此后細(xì)胞增殖旺盛，原代培養(yǎng)的細(xì)胞7～10天即達(dá)70％～80％融合，可進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)，傳代后細(xì)胞形態(tài)無大變化，體外培養(yǎng)10代以后，細(xì)胞的增殖速度無明顯減慢。細(xì)胞群體倍增時(shí)間為55小時(shí)左右。免疫化學(xué)染色鑒定70％的培養(yǎng)細(xì)胞呈CD44陽性。加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)2～4天后，培養(yǎng)皿中就出現(xiàn)含有空泡的脂肪細(xì)胞，1周后達(dá)高峰，同時(shí)細(xì)胞中小脂滴開始融合，，形成大的脂滴，并開始向外界分泌，油紅”O(jiān)”染色后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅染顆粒，證明細(xì)胞內(nèi)顆粒確為脂滴。 結(jié)論：1、本實(shí)驗(yàn)用酶消化法成功的從人體脂肪組織中培養(yǎng)出脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)方法比較經(jīng)濟(jì)、簡便，容易推廣。2、用免疫組化染色對培養(yǎng)出的細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)志CD44分子的鑒定，結(jié)果顯示70％的培養(yǎng)細(xì)胞陽性表達(dá)CD44分子，表明在人體脂肪組織中含有可為組織修復(fù)所利用的間充質(zhì)干細(xì)胞，但細(xì)胞成分并不純。3、用含有胰島素、地塞米松及異丁基甲基黃嘌呤的成脂培養(yǎng)基成功誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分化成為成熟的脂肪細(xì)胞，誘導(dǎo)作用明顯，方法簡便。 二、磷脂酰膽堿對體外培養(yǎng)的人脂肪細(xì)胞作用研究 研究背景：近年來，可注射性磷脂酰膽堿合劑被用于注射溶脂領(lǐng)域，即在需要減肥的部位皮下注射一種磷脂酰膽堿合劑以達(dá)到溶解脂肪的效果。此種方法由于簡單、易行，病人不用承受痛苦，不用造成新的創(chuàng)傷等優(yōu)點(diǎn)而有著廣闊的應(yīng)用前景。但對磷脂酰膽堿是否能溶解脂肪組織、對于人體是否有副作用以及溶解脂肪后的轉(zhuǎn)歸都有待探討。國內(nèi)外均缺乏相關(guān)的基礎(chǔ)研究。 目的：探索磷脂酰膽堿對體外培養(yǎng)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSCs)向成熟脂肪細(xì)胞分化時(shí)細(xì)胞內(nèi)脂肪積聚，以及對成熟脂肪細(xì)胞活性的作用。探討其作為皮下注射溶脂藥物的可能性。 方法：體外培養(yǎng)人皮下脂肪組織的脂肪干細(xì)胞，在其成脂培養(yǎng)基中分別加入不同濃度(0、0.05％、0.5％、5％)的磷脂酰膽堿，油紅“O”染色提取法測定細(xì)胞內(nèi)脂肪含量，在酶標(biāo)儀上測定OD值，運(yùn)用SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用不同濃度(0、0.05％、0.5％、5％)的磷脂酰膽堿干預(yù)成熟脂肪細(xì)胞生長，分別在干預(yù)3天、5天、7天后用吖啶橙(AO)／溴化乙啶(EB)染色觀察細(xì)胞活性情況。 結(jié)果：磷脂酰膽堿可明顯抑制脂肪干細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化時(shí)胞內(nèi)脂肪積聚，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示，時(shí)間相同時(shí)各濃度之間OD值與空白對照組比較均有顯著性意義(P＜0.05)，濃度相同時(shí)，隨著時(shí)間變化，各時(shí)間組OD值之間均有顯著性差異(P＜0.05)；AO／EB染色：空白對照組的核染色顯示明亮的綠色熒光，顯示細(xì)胞活性良好。和同時(shí)間的空白對照組比較，0.05％濃度的磷脂酰膽堿對成熟脂肪細(xì)胞作用3天后表現(xiàn)為誘導(dǎo)凋亡作用，核黃綠色，呈固縮狀。0.5％濃度在作用3天、5天、7天后細(xì)胞均表現(xiàn)為壞死狀態(tài)，核呈橘紅色熒光。5％濃度對細(xì)胞破壞最為嚴(yán)重，作用5天時(shí)細(xì)胞開始完全壞死，出現(xiàn)細(xì)胞溶解，作用7天時(shí)幾乎看不到細(xì)胞結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：1、磷脂酰膽堿對脂肪干細(xì)胞分化過程中脂肪積聚呈抑制作用。時(shí)間相同時(shí)，濃度越高，這種抑制作用越明顯，濃度相同時(shí)，時(shí)間越長，抑制作用越明顯。其中5％濃度組對脂肪細(xì)胞的破壞作用最顯著。2、通過AO／EB染色證實(shí)了低濃度的磷脂酰膽堿對成熟脂肪細(xì)胞有誘導(dǎo)調(diào)亡作用，而高濃度對成熟脂肪細(xì)胞有破壞作用。作用機(jī)理可能與其破壞細(xì)胞膜有關(guān)。
[Abstract]:Experimental study on the isolation and culture of mesenchymal stem cells from human adipose tissue
Background: seed cells is the primary material basis for tissue engineering. Stem cells can regenerate in vitro because of its high growth rate and differentiation potential of seed cells has become a hot research topic. In recent years, research shows that there is a certain amount of stem cells in adipose stromal cells (called adipose tissue derived mesenchymal stem cells, AMSCs), differentiate into osteoblasts under certain conditions can cartilage cells, bone cells, fat cells, myocardial cells and nerve cell differentiation. Although the study on AMSCs has some achievements, but there are still many problems need to be clarified. Such as fat tissue whether there really exists a class of stem cells. This kind of stem cells is MSCs in peripheral blood through the blood to penetrate the adipose tissue. How to build a simple, economic and easy to popularize in vitro culture method. The differentiated cells are sources of AMSCs, And how AMSCs's immunity is waiting to be discussed.
Objective: To explore the isolation, in vitro culture and biological characteristics of human adipose tissue derived mesenchymal stem cells (AMSCs), and to provide experimental basis for its extensive application.
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本文編號：1552984