本文關(guān)鍵詞： 融合基因 CFP YFP APP 突變 FRET 多光子共聚焦顯微鏡 C99　出處：《華中科技大學(xué)》2007年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的 構(gòu)建含有突變型APP的熒光真核表達(dá)系統(tǒng)以研究APP的酶解過程和Aβ產(chǎn)生的分子機(jī)制。 方法 以質(zhì)粒pcDNA3.0-CFP-CaM-YFP的BglII酶切產(chǎn)物為模板,通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分別得到編碼藍(lán)色熒光蛋白(cyan fluorescence protein, CFP)和黃色熒光蛋白堿基序列(yellow fluorescence protein, YFP);以pcDNA3.0-APP為模板,通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)得到含有APP717突變的最后300堿基片段(C99);生物合成含有Swedish突變的APP中間54個堿基片段(54bp)。利用基因工程技術(shù)將CFP、54bp、YFP、C99片段克隆至載體質(zhì)粒pcDNA3.0中,得到重組質(zhì)粒pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99和pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP,酶切和測序鑒定。將構(gòu)建的融合基因轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞中,通過RT-PCR檢測融合基因mRNA表達(dá),利用多光子共聚焦顯微鏡觀察不同時間點(12h、24h、48h、72h、96h)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的熒光蛋白表達(dá)情況。細(xì)胞轉(zhuǎn)染12h、18h、24h、36h、48h、72h后,檢測FRET,予以波長為820nm的CFP激發(fā)光激發(fā),采集發(fā)射波長為473nm的CFP圖像,同時采集發(fā)射波長為525nm的YFP圖像;計算CFP、YFP熒光強(qiáng)度(ICFP和IYFP)和兩者的比率(Fret=IYFP/ICFP),繪制曲線。pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后,利用多光子共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)黃色熒光蛋白的表達(dá)、分布以及YFP標(biāo)記的Aβ去向。免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定Aβ的生成。pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99、pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞12h、24h、36h、48h、72h、96h后,MTT檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞活性,了解Aβ對細(xì)胞的影響。 結(jié)果 1、CFP、YFP、C99的PCR產(chǎn)物大小分別為818bp、738bp、325bp,經(jīng)過不同的雙酶切得到的酶切產(chǎn)物大小分別為702bp、723bp和310bp,電泳證實與預(yù)期一致;重組質(zhì)粒pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99、pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP分別經(jīng)過不同的組合酶切,得到的目的片段長度正確;測序鑒定證明融合基因CFP-54bp-YFP-C99、CFP-54bp-YFP的序列與“gene bank”的堿基信息相符。 2、將轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR顯示有目的片段,分別對應(yīng)于CFP-54bp-YFP-C99和YFP-C99,對照細(xì)胞內(nèi)則無相應(yīng)片段。 3、轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)有藍(lán)色(和)黃色熒光表達(dá),在轉(zhuǎn)染12h后已經(jīng)可以觀察到細(xì)胞內(nèi)有熒光分布,24h熒光逐漸增多,至48h熒光進(jìn)一步增多增強(qiáng),72h熒光有所減少,96h熒光明顯減少減弱。 4、pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后始終存在FRET,細(xì)胞輪廓光滑;pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99細(xì)胞在轉(zhuǎn)染12h后有微弱FRET,以后無FRET,細(xì)胞內(nèi)有顆粒廣泛沉積。 5、CFP-54bp-YFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞Fret不變; CFP-54bp-YFP-C99轉(zhuǎn)染細(xì)胞Fret下降。 6、CFP-54bp-YFP-C99在轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后,能夠被β、γ分泌酶裂解產(chǎn)生Aβ。 7、Aβ產(chǎn)生于首先細(xì)胞內(nèi),聚集成顆粒,廣泛分布于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞膜上,細(xì)胞外間隙也有少量分布,但沒有形成明顯沉積。 8、Aβ形成后細(xì)胞形態(tài)異常。 9、免疫細(xì)胞化學(xué)進(jìn)一步證實Aβ的生成。 10、MTT證實細(xì)胞內(nèi)聚集的Aβ使得細(xì)胞活性下降,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論 1、熒光標(biāo)記并含有Swedish (和APP717 )突變的重組質(zhì)粒pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP-C99和pcDNA3.0-CFP-54bp-YFP構(gòu)建成功。 2、融合基因在mRNA和蛋白水平均能夠正確表達(dá),為下一步研究APP裂解和Aβ產(chǎn)生提供了一種有力工具。 3、FRET能夠敏感準(zhǔn)確的檢測APP有無發(fā)生β裂解。 4、CFP-54bp-YFP-C99能夠被β分泌酶裂解而CFP-54bp-YFP不能被裂解,提示C99可能起到信號肽樣的引導(dǎo)定位作用,對β分泌酶裂解APP具有重要意義;干擾C99可能會抑制Aβ的產(chǎn)生,本實驗為探索AD的早期干預(yù)提供一種新思路。 5、融合基因能夠正確表達(dá)并被裂解,生成YFP標(biāo)記的Aβ。 6、Aβ產(chǎn)生于細(xì)胞內(nèi)多個部位,并有少量被分泌至細(xì)胞外。 7、Aβ在細(xì)胞外形成沉積之前,首先在細(xì)胞內(nèi)聚集并產(chǎn)生繼發(fā)性細(xì)胞毒作用,造成細(xì)胞活性下降,形態(tài)異常。
[Abstract]:Purpose A fluorescent eukaryotic expression system containing mutant APP was constructed to study the enzymatic hydrolysis process of APP and the molecular mechanism produced by A尾. method The expression of yellow fluorescence protein ( C99 ) was detected by polymerase chain reaction ( PCR ) . The expression of yellow fluorescent protein was detected by polymerase chain reaction ( PCR ) . The expression of yellow fluorescent protein was detected by polymerase chain reaction ( PCR ) . Understand the effect of A.beta . on cells . Results 1 . The size of the PCR products of cfp , YFP and C99 was 818bp , 738bp and 325bp , respectively , and the size of the digested products was 702bp , 723bp and 310bp , respectively . 2 . The transfected cells were RT - PCR to show the target fragments , which corresponded to the results showed that there were no corresponding fragments in the control cells . 3 . There were blue ( and ) yellow fluorescent expression in transfected cells . After 12 hours of transfection , the fluorescence distribution was observed in the cells , the fluorescence intensity increased at 24 hours , the fluorescence intensity increased at 48 hours , the fluorescence in 72h decreased , and the fluorescence of 96h decreased obviously . 4 . After transfection , the pcDNA3 . 0 - cfp - 54bp - YFP cells were all the same after transfection , the cell profile was smooth ; the pcDNA3 . 0 - cfp - 54bp - YFP - C99 cells had a weak fluorescence after 12 hours of transfection . 5 . Fret was not the same as that of Fret transfected with YFP - 54bp - YFP , and Fret was decreased by Fret - 54bp - YFP - C99 transfected cells . 6 . After 48 hours of transfection , the 尾 - and 緯 - secreting enzymes could be cleaved by 尾 and 緯 - secreting enzymes to produce A尾. 7 . A尾is produced in the first cell , aggregates into particles , is widely distributed in the cells and the cell membrane , and the extracellular space of the cells also has a small amount of distribution , but no significant deposition is formed . 8 . After formation of A.beta . , the cell morphology was abnormal . 9 . Immunocytochemistry further confirmed the formation of A尾. 10 . MTT proved that the aggregation of A尾 in the cells decreased the activity of the cells , which was statistically significant as compared with the control group . Conclusion 1 . The recombinant plasmid pcDNA3 . 0 - cf4 - 54bp - YFP - C99 and pcDNA3 . 0 - cfp - 54bp - YFP were constructed successfully . 2 . The fusion gene can be expressed correctly at mRNA and protein levels , and provides a powerful tool for the next study of APP cleavage and A.beta . production . 3 . fret can sensitively and accurately detect whether or not the APP undergoes beta cracking . 4bp - 54bp - YFP - C99 can be cleaved by 尾 - secretory enzymes , and the Qp - 54bp - YFP can not be cleaved . It is suggested that C99 may play a role in signal peptide - like guidance and localization , and it has important significance for the cleavage of APP . The interference C99 may inhibit the production of A.beta . , and this experiment provides a new idea for exploring early intervention of AD . and 5 , the fusion gene can be correctly expressed and cleaved to generate a YFP labeled A beta . 6 . A . beta . is generated in a plurality of sites in the cell and a small amount is secreted out of the cell . 7 . A . beta . is first accumulated in the cells and secondary cytotoxic effects are generated before the formation of a deposit outside the cell , resulting in a decrease in cell activity and abnormal morphology .

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R346

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1545339