本文關(guān)鍵詞： E2F3 Trizol PCR 克隆 表達 Western blot　出處：《西北大學》2005年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:E2F轉(zhuǎn)錄因子是細胞周期中G1期進入S期的重要調(diào)控因子。同時,E2F因子與腫瘤的發(fā)生和細胞凋亡有著緊密的關(guān)系。為了研究人E2F3(E2F家族成員)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能,了解其與腫瘤發(fā)生的聯(lián)系,從人組織中克隆E2F3基因,構(gòu)建其原核表達載體和真核表達載體,實現(xiàn)其原核表達和真核表達,從而為進一步的研究奠定基礎。 方法:通過Trizol法抽提人肝癌細胞的總RNA,然后逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以cDNA為模板通過巢式PCR和橋聯(lián)PCR的方法克隆E2F3基因,構(gòu)建了四種E2F3基因的原核表達載體pET28a-E2F3、pET32a-E2F3、pQE30-E2F3和pGEX-4T-E2F3和一種真核表達載體pEGFP-N1-E2F3。原核表達載體轉(zhuǎn)化BL21工程菌進行誘導,用Western blot檢測重組蛋白。真核表達載體轉(zhuǎn)染T24細胞觀察克隆的E2F3基因在真核細胞中有無表達活性。 結(jié)果:成功克隆出E2F3全長基因,通過更換不同的表達載體實現(xiàn)了對E2F3基因的原核表達并且對表達的重組蛋白用Western方法進行了檢測。另外還構(gòu)建了E2F3基因的真核表達載體,通過轉(zhuǎn)染T24細胞表明構(gòu)建的E2F3真核表達載體具有表達活性,這為以后的細胞學實驗做好了前期的準備。 結(jié)論:E2F3基因近5’端一段富含GC的序列會嚴重影響E2F3基因的PCR擴增,我們推測這段序列可能是E2F3基因的一個內(nèi)部調(diào)控區(qū),它可能會通過形成二級發(fā)夾結(jié)構(gòu)來調(diào)控E2F3基因的表達。另外發(fā)現(xiàn)E2F3基因在不同的原核表達載體中存在表達差異,融合有GST的E2F3基因較易實現(xiàn)原核表達,這可能是因為表達載體功能元件的差異和E2F3基因本身的一些特點所致。
[Abstract]:Objective : E2F transcription factor is an important regulator of cell cycle G1 phase to enter S phase . In order to study the structure and function of the transcription factor of E2F3 ( E2F family member ) and to understand its association with tumor , the E2F3 gene is cloned from human tissue , its prokaryotic expression vector and eukaryotic expression vector are constructed , and its prokaryotic expression and eukaryotic expression vector are constructed , thus laying the foundation for further research .








鏂規(guī)硶:閫氳繃Trizol娉曟娊鎻愪漢鑲濈檶緇嗚優(yōu)鐨勬，

本文編號：1543132