本文關鍵詞： hCGβ 人分子佐劑hC3d 免疫避孕 抗hCGβ避孕疫苗 協(xié)同刺激分子 免疫效應　出處：《復旦大學》2006年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 目的從人肝cDNA文庫克隆C3基因片段hC3d，將三個拷貝的hC3d與hCGβ基因融合，構建攜分子佐劑的hCGβ-hC3d3融合蛋白和hCGβ蛋白的分泌型真核表達質粒，體外獲得穩(wěn)定高效表達細胞株，并獲得較高純度的目的蛋白hCGβ-hC3d3和hCGβ。目的蛋白體外作用于人外周血免疫細胞，以了解融合蛋白hCGβ-hC3d3的免疫原性及免疫效應，探討分子佐劑hC3d的作用機制，為重組hCGβ-hC3d3融合蛋白疫苗最終用于人類奠定基礎。 方法以人肝cDNA文庫為模板，PCR擴增hC3d基因片段，插入pMD18-T simple載體，構建含三個拷貝hC3d的pMD18-T-hC3d3質粒；以phCMV1-6his-hCGβ為模板擴增帶有相應酶切位點的hCGβ基因片段，將其構建入高效真核表達載體pCI-gs得到pCI-gs-signal-6His-hCGβ真核表達質粒。將hCGβ基因片段插入pMD18-T-hC3d3質粒，使hCGB與hC3d3基因融合，再構建入pCI-gs獲得pCI-gs-signal-6His-hCGβ-hC3d3真核表達質粒。脂質體法介導重組質粒pCI-gs-signal-6His-hCGβ、pCI-gs-signal-6His-hCGβ-hC3d3轉染中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，序列濃度MSX篩選抗性細胞克隆；化學發(fā)光法檢測抗性克隆培養(yǎng)上清hCGβ含量，以選擇高效表達克隆。Western blotting鑒定目的蛋白；Raji細胞免疫化學染色法鑒定hCGβ-hC3d3融合蛋白。采用針對6His的鎳柱結合凝膠過濾層析純化表達產(chǎn)物。 用L-亮氨酸甲基酯(L-LME)或B細胞磁珠陰性分離試劑盒對人外周血單個核細胞(PBMC)進行細胞分離純化；實驗分四組：B細胞、B+T細胞組、PBMC和Raji細胞組。分別應用1nM、10nM、100nM不同濃度的hCGβ、hCGβ-hC3d3及美洲商陸(PWM)等抗原體外作用于以上細胞10-12d，用ELISA檢測培養(yǎng)上清中總免疫球蛋白(Ig)及抗hCGβ抗體的分泌水平；用氚標記的胸腺嘧啶核苷(~3H-TdR)摻入法了解不同抗原刺激后各組細胞增殖情況，而ELISPOT可測定各種抗原刺激后Ig或特異抗體的分泌細胞數(shù)量。另外，為探討分子佐劑hC3d3的作用機制，用100nM的hCGβ、hCGβ-hC3d3或PWM等抗原與B細胞、B+T細胞、PBMC細胞體外作用48h，用ELISA檢測培養(yǎng)上清中IL-2濃度；用熒光抗體標記培養(yǎng)細胞，流式細胞儀檢測B細胞、T細胞表面協(xié)同刺激分子CD80、CD86、CD154的表達情況及Th細胞活化后IL-2Rα鏈(CD25)的表達水平。 結果分子克隆的hC3d基因片段的測序結果與目的基因一致。酶切鑒定及測序結果顯示，pMD18-T-hC3d3、pCI-gs-signal-6His-hCGβ、pCI-gs-signal-6His-hCGβ-hC3d3重組質粒構建正確。轉染CHO細胞后，經(jīng)抗性克隆篩選，各挑選出一個高表達細胞株，化學發(fā)光法檢測其培養(yǎng)上清中hCGβ的含量結果顯示，pCI-gs表達效率明顯高于pcDNA和phCMV1。Western blotting分析顯示，pCI-gs-signal-6His-hCGβ的表達產(chǎn)物為24KDa；而pCI-gs-signal-6His-hCGβ-hC3d3的表達產(chǎn)物有三種，大小分別為136 KDa、100 KDa、64 KDa。鎳柱結合分子篩純化可獲得較高純度的融合蛋白hCGβ-hC3d3和hCGβ。 用不同濃度hCGβ、hCGβ-hC3d3及PWM作用于B細胞、B+T細胞、PBMC、Raji細胞10～12d后，~3H-TdR摻入法分析顯示：與hCGβ處理組相比，融合蛋白hCGβ-hC3d3能使各組細胞增殖明顯升高，且呈濃度依賴性�？侷g水平檢測結果表明，100nM hCGβ-hC3d3與前三組細胞共培養(yǎng)上清中總Ig的含量分別為hCG B刺激組的4倍、10倍和10.85倍；且呈濃度依賴性。ELISPOT結果與上清檢測結果類似，經(jīng)與hCGβ-hC3d3共培養(yǎng)后Ig生成細胞較hCGβ組明顯增加。用100nM的不同抗原共培養(yǎng)12d后，取培養(yǎng)上清進行ELISA檢測，結果表明，經(jīng)hCGβ及PWM刺激后，上清中均未檢測到抗hCGβ特異性抗體；與hCGβ-hC3d3培養(yǎng)后則在B+T細胞、PBMC組可見低水平抗hCGβ抗體。用ELISPOT法分析抗hCGβ特異性抗體生成細胞，結果發(fā)現(xiàn)，hCGβ刺激的細胞僅有數(shù)個散在的陽性細胞；而經(jīng)hCGβ-hC3d3刺激后，陽性細胞明顯增多(P＜0.05)。 流式細胞術分析結果提示：與hCGβ比較，hCGβ-hC3d3蛋白能顯著上調(diào)B細胞表面CD80、CD86分子的表達，尤其是CD86分子的表達；能明顯增強T細胞表面CD154、CD25分子的表達(P＜0.05)。hCGβ-hC3d3蛋白能提高B細胞抗原提呈的能力及T細胞活化后分泌IL-2的能力(P＜0.05)。 結論成功克隆了人hC3d基因片段，實現(xiàn)了hC3d3與hCGβ的基因融合；構建了pCI-gs-signal-6His-hCGβ，pCI-signal-6His-hCGβ-hC3d3真核表達質粒；并在CHO細胞中獲得hCGβ蛋白、hCGβ-hC3d3融合蛋白的高效分泌性穩(wěn)定表達。鎳柱結合分子篩可獲得較高純度的目的蛋白。hCGβ-hC3d3可通過提高人外周血B細胞及T細胞表面協(xié)同刺激分子的表達，促進B細胞活化，，改善其抗原提呈能力，加強B細胞T細胞間相互作用，有效活化T輔助細胞；分子佐劑hC3d能增強人外周免疫活性細胞對hCGβ抗原的反應性，顯著提高B細胞合成Ig及特異性抗體的能力。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：1514526