發(fā)布時間：2018-02-09 11:07

  本文關(guān)鍵詞： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 增殖 分化 褪黑素 褪黑素受體　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的:探討褪黑素(melatonin,Mel)對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcells,MSCs)增殖分化的作用,以期優(yōu)化MSCs擴(kuò)增及向神經(jīng)元樣細(xì)分化的實驗參數(shù);研究Mel干預(yù)的MSCs上Mel受體亞型mRNA的表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法:1.以密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)方法分離MSCs,以含15%胎牛血清L-DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),用流式細(xì)胞儀檢測CD45、CD44、CD105。2.取傳至6代的MSCs,加入不同濃度的Mel,MTT法分別檢測24小時、3天、5天細(xì)胞的增殖情況;免疫細(xì)胞化學(xué)法和RT—PCR法檢測Mel誘導(dǎo)后24h、3天、5天MSCs表面NSE、GFAP的表達(dá)。3.RT—PCR法測定Mel誘導(dǎo)的第6代MSCs上,Mel受體MT_1和MT_2mRNA的表達(dá)情況:提總RNA,逆轉(zhuǎn)錄,PCR擴(kuò)增,凝膠電泳,體外基因測序。 結(jié)果:1.MSCs接種后貼壁良好,折光性強(qiáng),3天后可見梭狀或多邊形細(xì)胞呈集落狀生長,傳代迅速,至第5～6代時呈現(xiàn)較均一的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。流式細(xì)胞法檢測結(jié)果為:CD44~-、CD105~+、CD45~-,證明為較純的MSCs。2.加入Mel后,實驗組MSCs增殖情況和對照組比較,差異不顯著。加入Mel后24小時鏡下觀察見MSCs形態(tài)發(fā)生變化,寬大扁平的細(xì)胞體向胞核收縮,出現(xiàn)雙極及多極細(xì)胞,有細(xì)長突起,3天后變形細(xì)胞增多,細(xì)長突起相互連接、交織。持續(xù)至5天后變形細(xì)胞達(dá)到高峰。免疫細(xì)胞化學(xué)法測得誘導(dǎo)后24h、3d、5d Mel高濃度組和低濃度組的NSE染色陽性率較對照組差異顯著;各組GFAP染色均呈陰性。3.RT—PeR:提MSCs總RNA,行RT-PeR,瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)一陽性條帶,分子量約為370bp,與MT_1引物核苷酸數(shù)目(368bp)相符合,320bp附近未出現(xiàn)陽性條帶。測序結(jié)果示,擴(kuò)增獲得的基因序列與Genbank中人MT_1受體亞型的基因序列相吻合。 結(jié)論:1.本實驗采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁純化MSCs,建立了穩(wěn)定的MSCs培養(yǎng)增值體系,細(xì)胞成活率高,貼壁良好,可連續(xù)傳15代。該采集方法簡便易行,體外擴(kuò)增容易,細(xì)胞獲得豐富,可推薦為MSCs研究的常規(guī)培養(yǎng)方法。2.在Mel誘導(dǎo)下,MSCs可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞;Mel對MSCs的增殖無明顯作用。3.本實驗用RT-PCR技術(shù),初步證實被Mel誘導(dǎo)的MSCs存在MT_1受體mRNA的表達(dá);通過測序,擴(kuò)增所獲得的基因序列與GenBank的人MT_1受體亞型的基因序列相一致,提示Mel干預(yù)的MSCs存在MT_1受體mRNA的表達(dá)。本實驗未檢測到亞型MW_2 mRNA的表達(dá),可能因為Mel干預(yù)的MSCs不存在MT_2mRNA的表達(dá)。
[Abstract]:Objective: to investigate the effect of melatonin on the proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) of human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) in order to optimize the experimental parameters of MSCs amplification and neuron-like fine differentiation, and to study the expression of Mel receptor subtype mRNA on MSCs induced by Mel. To lay a foundation for further research and clinical application. Methods 1. MSCs were separated by density gradient centrifugation combined with adherent culture, and cultured on L-DMEM medium containing 15% fetal bovine serum. Flow cytometry (FCM) was used to detect CD45, CD44and CD105.2. The proliferation of cells was detected by different concentrations of Melton-MTT assay after 6 passages of MSCs were added to detect the proliferation of cells in 24 hours and 3 days and 5 days respectively. Immunocytochemistry and RT-PCR methods were used to detect the expression of MSCs on MSCs surface at 3 and 5 days after Mel induction. 3. RT-PCR was used to detect the expression of Mel receptor MT_1 and MT_2mRNA on the sixth generation MSCs induced by Mel: total RNAs, RT-PCR amplification, gel electrophoresis and gene sequencing in vitro. Results\\\%\\%\\\%\%\%\%\%\%. The results of flow cytometry were as follows: 1. The results of flow cytometry were as follows: 1. The results of flow cytometry showed that it was a pure MSCs.2.After the addition of Mel, the proliferation of MSCs in the experimental group was compared with that in the control group. The morphologic changes of MSCs were observed under microscope 24 hours after the addition of Mel. The large, flat cell bodies contracted to the nucleus, bipolar and multipolar cells appeared. After 3 days, the number of deformable cells increased and the slender processes were connected with each other. The positive rates of NSE staining in high concentration and low concentration Mel groups were significantly higher than those in control group 24 h after induction at 3 d and 5 d after induction by immunocytochemistry. GFAP staining was negative in all groups. RT-PeR: total MSCs RNA was extracted. A positive band was detected by RT-PeR and agarose gel electrophoresis with a molecular weight of about 370 BP, which coincided with the number of MT_1 primer nucleotides and there were no positive bands in the vicinity of 320bp. The amplified gene sequence coincided with the gene sequence of human MT_1 receptor subtype in Genbank. Conclusion 1. In this experiment, a stable culture system of MSCs was established by density gradient centrifugation combined with adherent purification. The cell survival rate was high, the adherent was good, and the cells could be transmitted for 15 consecutive generations. The method was simple and easy to amplify in vitro. The cells were abundant and could be recommended as a conventional culture method for the study of MSCs. (2) MSCs could differentiate into neuron-like cells. Mel had no obvious effect on the proliferation of MSCs. 3. RT-PCR technique was used in this experiment. The expression of MT_1 receptor mRNA in MSCs induced by Mel was preliminarily confirmed, and the sequence obtained by sequencing was consistent with that of human MT_1 receptor subtype of GenBank. The results suggested that MT_1 receptor mRNA was expressed in MSCs treated with Mel, but no expression of MW_2 mRNA was detected in this study, which may be due to the absence of MT_2mRNA expression in Mel induced MSCs.
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R329

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