本文關鍵詞： 整合素α_v 胞內功能域 AWP1 蛋白質-蛋白質相互作用 凋亡　出處：《第一軍醫(yī)大學》2006年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 蛋白激酶C相關激酶(protein kinase C related kinase，PRK)與蛋白激酶C相似，，最初PRKs被確定為蛋白酶激活的絲／蘇氨酸激酶，并且被命名為蛋白酶活激酶(protease-activated kianse，PAK)。PRK的羧基端結構域有50％與蛋白激酶C的羧基端結構域同源，因此被稱為PRK。而PRK氨基端的結構域是獨特的，與蛋白激酶C的不同，這可能是PRK與蛋白激酶C能夠分別被不同的脂質激活的原因。PRK能夠被磷脂尤其是心磷脂(cardiolipin)激活，但是不能被Ca~(2+)、甘油二酯(diacylglyerol)、佛波酯(phobol ester)、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine)激活。蛋白激酶C相關激酶1(protein kinase C related kinase 1，PRK1)是PRKs家族最具特色的成員，它能夠通過氨基端與GTP結合蛋白RhoA結合，并以GTP依賴模式被激活。PRK1能夠與不同的細胞分子相關或相互作用，主要是結構蛋白如：波形蛋白(vimentin)，神經(jīng)膠質纖酸蛋白，α-肌動蛋白(α-actin)以及神經(jīng)絲蛋白(neurofilament protein)等。已有報道證實，PRK1在凋亡過程中具有特殊的作用。 PRK1相關蛋白(associated with PRK1，AWP1)，是用人CDC34作誘餌，利用酵母雙雜交系統(tǒng)鑒定出來的一個與CDC34相互作用的蛋白質。它能夠在哺乳動物細胞中與PRK1發(fā)生免疫共沉淀。AWP1是一個全新的蛋白質，全長cDNA序列中擁有一個627bp的開放閱讀框，分子量大小為22.56kD。AWP1廣泛存在于多種組織中，在人與鼠胚胎發(fā)育的早期就已經(jīng)出現(xiàn)。深入探討AWP1在人及鼠早期胚胎發(fā)育過程中的作用具有重要意義。AWP1能夠通過調節(jié)PRK1的亞細胞定位參與復雜的細胞信號網(wǎng)絡，在信號轉導通路中擔當一個信號分子的角色。分析AWP1的氨基酸序列可以發(fā)現(xiàn)其兩端各有一個鋅指結構域。其中，人AWP1氨基端保守的鋅指結構域A20位于11-35位氨基酸，羧基端保守的鋅指結構域AN1位于149-189位氨基酸。一直以來，鋅指結構域都被認為參與DNA結合并在轉錄因子中存在。最近有研究發(fā)現(xiàn)，鋅指結構域也能夠參與蛋白與蛋白的相互作用。A20蛋白能夠被大量的免疫刺激因素誘導，是凋亡的抑制劑。它的鋅指結構域能夠與蛋白激酶C相連。因此，AWP1的鋅指結構域A20極有可能參與蛋白-蛋白的相互作用。 同時，AWP1也是強烈的NF-κB抑制劑，由此可見，AWP1可能在哺乳動物信號轉導通路中起到重要調控的作用。從AWP1的發(fā)現(xiàn)和它的蛋白功能結構域分析可以看出，AWP1具有與多種蛋白分子相互作用的潛能。 整合素是細胞表面受體的一個大家族，它是由非共價鍵聯(lián)結α亞基和β亞基組成的異二聚體。α_v亞基是整合素家族獨特的成員之一，能與至少5種不同的β亞基相聯(lián)結，參與細胞遷移、增殖、分化和基因轉錄等，尤其在腫瘤惡性轉移和新生血管形成中具有特殊作用。整合素的胞內結構域在整合素介導的細胞功能中具有重要作用。整合素通過胞內結構域與細胞骨架、信號分子及其他的細胞內蛋白相互作用，介導雙向跨膜的生理功能。近年來的大量研究證明，細胞內的很多蛋白能夠與整合素胞內功能域直接作用，這種相互作用在整合素調控的生物反應中具有重要作用。整合素在細胞黏附、遷移、分化、增殖及細胞程序性死亡中具有重要作用。 我們前期利用整合素α亞基胞漿內段作為“餌”，利用酵母雙雜交系統(tǒng)鑒定到了一個與其相互作用的陽性克隆——AWP1蛋白。蛋白質氨基酸序列以及cDNA核苷酸序列的計算機比較分析顯示，整合素α_v亞基胞內結構域與CDC34序列極其相似。既然AWP1與CDC34、PRK1之間具有相互作用，那么它與整合素α_v亞基胞內結構域是否也存在相互作用呢? 在前期的離體結合研究中我們已經(jīng)證實，AWP1蛋白在體外能夠與整合素α_v亞基胞內結構域特異性結合，并且這種作用與α_v，亞基胞內結構域Y~(986)酪氨酸殘基的作用密切相關。既然兩者的相互作用在體外狀態(tài)下存在，那么在體內這種相互作用仍有可能存在。這個問題在闡明兩者的生理功能中有著相當重要的意義。 利用基因重組技術構建缺乏Y~(986)氨基酸的α_v亞基胞內結構域(α_v-C)及含有Y~(986)氨基酸的α_v亞基胞內結構域(α_v-CY)的pEGFP-C2融合蛋白表達載體，并在HEK293細胞中表達，觀察其在細胞內的表達與定位。 構建pEGFP-C2／AWP，pcDNA3／HA-α_v及pcDNA3／HA-α_v(Y986F)表達質粒，其中α_v(Y986F)是將野生型α_v的Y~(986)突變?yōu)楸奖彼?F)。將pEGFP-C2／AWP1分別與pcDNA3／HA-α_v、pcDNA3／HA-α_v(Y986F)共轉染ECV304細胞，用免疫熒光共定位法檢測兩者在細胞內的定位。結果發(fā)現(xiàn)，當與pcDNA3／HA-α_v(Y986F)共轉染細胞時，GFP-AWP1融合蛋白彌散分布于細胞中。而與pcDNA3／HA-α_v共轉染細胞時，GFP-AWP1融合蛋白定位于細胞漿近膜側。這提示兩者在哺乳動物細胞中存在相互作用。并且Y~(986)酪氨酸殘基在兩者的相互作用中具有重要作用。 將pEGFP-C2／AWP1質粒轉染ECV304細胞，發(fā)現(xiàn)GFP-AWP1融合蛋白彌散分布于細胞質中。如果以纖連蛋白Fn(fibronectin，F(xiàn)n)對細胞進行刺激，則GFP-AWP1融合蛋白主要定位于細胞漿近膜側。 采用兩步克隆的方法將整合素α_v、突變型α_v(Y986F)及人AWP1編碼序列分別構建入帶有增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)標簽的腺病毒穿梭質粒pAdTrack-CMV中，采用化學轉化法在大腸桿菌BJ5183內與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1同源重組，得到重組腺病毒載體，并轉染人胚腎細胞HEK293A，包裝成重組病毒顆粒。為進一步研究α_v及AWP1的功能提供了重要的實驗材料。同時發(fā)現(xiàn)，α_v過表達能夠明顯增強人肝癌細胞SMMC-7721的黏附能力。AWP1過表達則能夠促進人肝癌細胞SMMC-7721細胞及血管內皮細胞ECV304的增殖，暗示AWP1可能是凋亡的抑制劑，并且它的抑制作用可能與鋅指結構域A20的功能有關。 通過上述研究，初步得出以下結論： 1．AWP1可能與α_v有相互作用，這種相互作用與Y~(986)的作用有關。 2．α_v過表達能夠明顯增強人肝癌細胞SMMC-7721的黏附能力。 3．AWP1過表達能夠促進SMMC-7721、ECV304細胞的增殖，提示AWP1可能是凋亡的抑制劑。
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【學位授予單位】：第一軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R341

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本文編號：1489190