發(fā)布時間：2018-02-01 10:15

  本文關(guān)鍵詞： 西尼羅病毒 多表位基因疫苗 密碼子優(yōu)化 免疫保護作用　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2007年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 西尼羅病毒(West nile virus，WNV)屬蟲媒病毒科黃病毒屬，能引起人畜共患性疾病。1937年該病毒首次在烏干達西尼羅河地區(qū)一個發(fā)熱婦女的血液中分離到并因此得名。其后在非洲、中東、中亞和西歐等地區(qū)先后有西尼羅病毒感染的報道，涉及數(shù)十個國家和地區(qū)。上世紀90年代以來，爆發(fā)感染的地區(qū)明顯增加。1999年西尼羅病毒開始在美國紐約地區(qū)發(fā)生爆發(fā)性大流行，隨后向各地蔓延。據(jù)美國疾病控制與預防中心報道，2004年美國共發(fā)生西尼羅病毒感染9175人，其中有230人已死亡。到目前為止，針對西尼羅病毒感染仍無有效的治療方法，真正用于預防西尼羅病毒的疫苗主要為滅活疫苗，且僅限于在馬群中應用。 表位(epitope)是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團，又稱抗原決定簇(antigenic determinant)。它是T細胞抗原受體(T cell receptor，TCR)和B細胞抗原受體(B cell receptor，BCR)與抗體特異結(jié)合的基本單位。在免疫應答中，TCR和BCR所識別的抗原表位不同，分別被稱為T細胞表位和B細胞表位。作為理想的免疫原，抗原分子中應同時包含目的抗原B細胞表位和自身或外源T細胞表位，才能誘導出高度特異性的體液及細胞免疫反應，從體液免疫和細胞免疫水平起到預防或治療作用，賦予較廣泛的保護性。表位疫苗是近年來病毒新型疫苗研究的熱點。目前關(guān)于西尼羅病毒多表位疫苗的研究尚未見報道。 基于此，本研究在西尼羅病毒多表位疫苗方面進行了探索性研究。在對西尼羅病毒全基因序列進行比對分析的基礎(chǔ)上，確定可能作為表位的基因序列，并通過串聯(lián)方式進行連接得到多表位基因，同時對該序列進行密碼子優(yōu)化。利用原核表達載體系統(tǒng)，觀察多表位基因的表達情況及其重組蛋白在家兔體內(nèi)的免疫原性。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建含有西尼羅病毒多表位基因的真核重組質(zhì)粒DNA，并采用多種方式對小鼠進行免疫，觀察其誘導免疫應答水平的能力和差異，為研制具有高免疫原性的西尼羅病毒多表位核酸疫苗提供依據(jù)。 首先，我們利用生物分析軟件對西尼羅病毒China 01株全基因序列進行分析，得出可作為抗原表位的不同基因序列，結(jié)合文獻確定目的基因(M)由4個表位序列(分別編碼C蛋白第98-106 AA，，PrM蛋白第73-91 AA，E蛋白第307—332 AA，NS1蛋白第252-260 AA)和3個連接肽基因組成，共計210個堿基。分別采用原核表達常用密碼子和哺乳動物偏好密碼子對該基因序列進行優(yōu)化，使之適合于原核細胞和真核細胞表達。 其次，通過重疊PCR方法擴增該基因片段，得到多表位基因cDNA分子。將擴增產(chǎn)物克隆到原核表達載體pET-43a(+)，獲得重組質(zhì)粒pET-43-M。將原核重組質(zhì)粒pET-43-M導入大腸桿菌中進行表達，表達的融合蛋白Nus-M經(jīng)SDS—PAGE電泳后進行免疫印跡檢測。檢測結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pET-43-M可在原核細胞中大量表達，表達產(chǎn)物具有特異的西尼羅病毒抗原性。原核表達的Nus-M蛋白經(jīng)過純化、定量后，混合弗氏佐劑，采用多點皮下注射方式免疫白兔，免疫間隔為2周，共免疫3次，每次每只500μg。應用ELISA方法和間接免疫熒光法檢測抗體產(chǎn)生情況和效價。結(jié)果顯示，在第二次免疫后，兔體內(nèi)已經(jīng)產(chǎn)生針對Nus-M蛋白的抗體，在第三次免疫后達到高峰，以后逐漸下降。免疫結(jié)果顯示，重組蛋白能誘導產(chǎn)生特異性的高效價抗體。 第三，利用真核表達載體pcDNA3.1構(gòu)建西尼羅病毒真核重組質(zhì)粒pcDNA—M。將重組質(zhì)粒pcDNA—M轉(zhuǎn)染BHK21細胞，采用RT-PCR方法檢測到重組質(zhì)粒在真核細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄，間接免疫熒光法在細胞胞漿中檢測到西尼羅病毒的特異蛋白抗原，表明真核重組質(zhì)�？稍谡婧思毎麅�(nèi)表達，并且表達產(chǎn)物具有西尼羅病毒抗原性。 第四，進一步觀察西尼羅病毒多表位基因重組質(zhì)粒DNA的免疫反應性，同時比較重組質(zhì)粒DNA免疫、初始DNA免疫加重組蛋白加強和DNA加佐劑免疫等不同免疫方式誘導免疫應答反應的差異。結(jié)果顯示，三種免疫方案均能誘導小鼠產(chǎn)生針對西尼羅病毒的特異性中和抗體，中和抗體效價分別達到1∶52、1∶85和1∶90．重組蛋白加強和免疫佐劑均能有效提高重組質(zhì)粒誘導體液免疫應答反應。進一步分析細胞免疫反應證實，重組質(zhì)粒DNA組、初始DNA免疫加重組蛋白加強組和加免疫佐劑組均能夠誘導小鼠產(chǎn)生特異性細胞免疫，各組小鼠脾細胞經(jīng)過CoA刺激后，其特異性CTL殺傷率分別達到18.9％(E／T=20／1)、32.1％(E／T=20／1)和47.7％(E／T=20／1)，刺激指數(shù)分別為4.10±1.34、3.80±0.12和7.81±0.13，明顯高于對照組。 第五，病毒攻擊觀察重組西尼羅病毒多表位基因疫苗的免疫保護作用。取經(jīng)不同免疫途徑免疫后的BALB／C小鼠，分別在每只小鼠顱內(nèi)注射100 LD_(50)的西尼羅病毒懸液，然后連續(xù)觀察2周，統(tǒng)計各組死亡數(shù)并計算保護率。結(jié)果顯示，初始DNA免疫加重組蛋白加強組和DNA加佐劑組保護率高，達到62.5％，重組質(zhì)粒DNA組保護率為50％，而單純采用重組融合蛋白免疫組保護率最低，只有25％。這些結(jié)果表明，重組的西尼羅多表位基因疫苗對防止西尼羅病毒感染具有較好的保護作用。 本研究表明，構(gòu)建的西尼羅病毒多表位基因疫苗能夠刺激動物產(chǎn)生特異性的細胞免疫和體液免疫應答反應，對西尼羅病毒感染具有保護作用，為進一步研發(fā)高效價的西尼羅病毒多表位疫苗奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

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