本文關鍵詞： 干酪乳桿菌細胞壁成分 冠狀動脈炎 川崎病 疾病模型 小鼠 超抗原 干酪乳桿菌細胞壁成分 T細胞活化 CD69 TCR Vβ 血管炎 自身免疫性 小鼠 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應 BLT1 BLT2 mRNA 川崎病 冠狀動脈病變 丙種球蛋白 療效評　出處：《華中科技大學》2006年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 背景 川崎病(Kawasaki disease，KD)是一種常見的兒童自身免疫性血管炎綜合征，并發(fā)冠狀動脈瘤(CAA)和冠脈狹窄是青壯年猝死和心肌梗塞發(fā)生的重要原因，新近研究表明，兒童川崎病是成人缺血性心臟病發(fā)生的新的危險因素。川崎病已取代風濕熱成為兒童后天性心臟病的主要病因。雖然靜脈輸注丙種球蛋白(IVlG)和阿斯匹林聯(lián)合治療方案廣泛應用后，川崎病死亡率和冠狀動脈并發(fā)癥明顯下降，但近年發(fā)現(xiàn)IVIG治療耐藥病例增多。迄今病因及發(fā)病機制未明，目前認為川崎病符合感染性疾病和自身免疫性疾病兩大特征，細菌超抗原致病是引起川崎病的重要原因，川崎病異常的免疫激活，是由細菌或病毒毒素以超抗原機制介導引起的。但臨床川崎病研究取材困難，國內(nèi)外目前尚缺少公認的川崎病動物模型用于血管炎性損傷和冠狀動脈瘤形成的發(fā)生機制研究。本研究采用干酪乳桿菌細胞壁成分(Lactobacillus casei cell wall extract，LCWE)注入幼年小鼠腹腔，觀察能否引致小鼠冠狀動脈炎，旨在探討建立新的川崎病動物模型的可能性；探討LCWE的超抗原活性及其與小鼠血管免疫性損傷和冠狀動脈炎發(fā)生的關系及作用機制。并對臨床病例進行研究以客觀評價IVIG治療和預防川崎病冠狀動脈病變的療效，探討IVIG療效的影響因素。 第一部分 一、LCWE誘導小鼠川崎病冠狀動脈炎動物模型的建立 目的：探討干酪乳桿菌細胞壁成分誘導產(chǎn)生川崎病冠狀動脈炎動物模型的可能性。 方法：制備LCWE(1mg／ml)。將100只BALB／C小鼠隨機分為實驗組和對照組各50只。分別腹腔注射0.5ml LCWE和PBS。注射后1d、3d、5d、10d、和28d每組取10只小鼠分批采血、處死、留取心臟病理標本。在光學顯微鏡和電子顯微鏡下觀察各器官組織病理變化；應用FACSort流式細胞儀檢測小鼠CD4~+、CD8~+T細胞亞群的百分比，計算外周血CD4~+、CD8~+T細胞亞群的絕對數(shù)量；采用夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法，檢測LCWE注射后3d小鼠血漿進行TNF-α、IL-1β和IL-6水平；并測量體重、心臟、脾臟重量、脾臟／體重及心臟／體重比值。 結(jié)果：①冠狀動脈炎損害的發(fā)生率：在實驗組小鼠為92.5％。②病理學改變：心臟標本HE染色光鏡檢查顯示冠狀動脈炎損害早期(1～3d)以中性粒細胞為主伴有少量淋巴細胞和單核細胞浸潤，血管中膜平滑肌細胞消失，晚期(28d)以巨噬細胞為主伴有少量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，冠脈管壁纖維細胞增生纖維化以及心內(nèi)膜、心外膜、心肌炎，升主動脈及小血管周圍炎。電鏡檢查顯示實驗組急性期冠狀動脈血管內(nèi)皮細胞大量廣泛空泡變性，壞死、脫落，基底膜疏松，嚴重線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴大，中膜增厚，中層細胞消失，纖維蛋白樣沉積等改變。對照組各階段心臟和血管均無炎癥。③免疫學指標：外周血T細胞亞群檢測顯示實驗組小鼠CD4~+與CD8~+T細胞亞群的絕對數(shù)量明顯增高(P＜0.05)，均在3d達到高峰：(8.23±1.32)×10~9／L及(6.19±1.08)×10~9／L。模型小鼠注射LCWE后3d血漿TNF-α、IL-1β及IL-6水平較對照組比較明顯增高，有顯著性差異。④實驗組小鼠在5d、10d時體重、心臟、脾臟重量及脾臟／體重、心臟／體重比值均較對照組降低，差異有極顯著性(P＜0.05)。 結(jié)論：LCWE單次腹腔注射能夠誘導BALB／C小鼠產(chǎn)生冠狀動脈炎及心肌炎病理改變，是一種能夠可靠反映川崎病冠狀動脈炎的良好動物模型。其群體發(fā)病率高，病理損害與LCWE誘導的免疫反應有關。 二、LCWE的超抗原活性及誘導小鼠冠狀動脈炎發(fā)生的超抗原機制 目的：研究超抗原LCWE激活小鼠T淋巴細胞TCR Vβ的特異性，LCWE刺激表達TCR Vβ2、4、6~+T細胞增殖的特征；研究LCWE激活小鼠T細胞CD69體內(nèi)外表達的動力學及其作用；探討LCWE的超抗原活性與小鼠血管免疫性損傷和冠狀動脈炎發(fā)生的關系及作用機制。 方法：①4～6周齡幼年BALB／C小鼠122只，隨機分為實驗組與對照組。按前述方法應用LCWE建立小鼠冠狀動脈炎動物模型。 ②小鼠分別腹腔注射超抗原LCWE、多克隆刺激劑Con A和PBS，應用流式細胞儀觀察超抗原刺激TCR Vβ_(2、4、6)~+T細胞增殖的動力學變化。檢測CD4~+CD69~+T細胞表達的百分率及動力學變化。 ③LCWE或Con A體外刺激BALB／C小鼠脾單個核細胞，觀察離體條件下LCWE與小鼠TCR Vβ結(jié)合的特異性；觀察LCWE5、10、15、20、25、40μg／ml或SEB 2.5μg／ml或Con A溶液(1mg／ml，20μl)終濃度10μg／ml或PBS刺激下；CD4~+T細胞CD69表達的陽性率及動力學變化。 ④采用夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法，檢測血漿IL-1β、IL-6和TNF-α水平。 ⑤應用相關模型觀察TCR Vβ6~+CD4~+T細胞增殖與T細胞活化CD69抗原表達和與血漿TNF-α水平變化的相關關系，TCR Vβ_6~+CD4~+T細胞增殖與血漿TNF-α水平變化的相關關系。 ⑥應用Logistic回歸模型，分析冠狀動脈炎發(fā)生與TCR Vβ~+T細胞增殖、與T淋巴細胞活化及與TNF-α產(chǎn)生的關系。 結(jié)果：①LCWE腹腔注射，刺激表達TCR Vβ_(2、4、6)的T細胞增殖，與注射前比較，P＜0.001；與腹腔注射Con A組比較，P＜0.05。 ②表達TCR Vβ家族的T細胞增殖之后，迅速出現(xiàn)增殖消退。實驗結(jié)果顯示CD4~+TCR Vβ6~+T細胞在注射LCWE 3d達高峰(11.11±1.08)％，5d下降回到基線(1.93％)，10d降至0.98％。表達TCR Vβ_2的CD4~+T細胞百分比的走勢及表達TCR Vβ_4的CD4~+T細胞百分比的走勢與CD_4~+TCR Vβ_6T細胞基本一致。 ③超抗原活性與小鼠冠狀動脈炎密切相關。LCWE注射后冠狀動脈炎的發(fā)生與TCR Vβ~+T細胞增殖、T淋巴細胞活化及TNF-α產(chǎn)生有關，Wald卡方值分別為12.473，P＜0.001、11.912，P＜0.05和3.469，P＜0.05。發(fā)生冠狀動脈炎組與未發(fā)生冠狀動脈炎組比較，TCR Vβ~+T細胞明顯增多，t=3.469，P＜0.001；淋巴細胞顯著活化，t=4.143，P＜0.001；TNF-α的水平增高，t=5.978，P＜0.001。實驗組有冠狀動脈炎發(fā)生者血漿TNF-α為2513.7±547.6，實驗組無冠狀動脈炎發(fā)生者血漿TNF-α為1179.3±295.9，兩組比較有顯著性差異，t=7.201，P＜0.001。 ④TCR Vβ6~+T細胞增殖和T細胞活化(CD69的增加)及TNF-α的產(chǎn)生密切相關，相關系數(shù)分別為r=0.884，P＜0.05：r=0.846，P＜0.001。CD69~+T細胞增殖與TNF-α產(chǎn)生密切相關，r=0.947，P＜0.05。 ⑤LEWC刺激體內(nèi)CD69~+T細胞表達的動力學變化顯示，BALB／C小鼠注射LCWE后，脾及外周血單個核細胞表達CD4~+CD69~+T細胞的百分率增高，與對照組比較有顯著差異，P＜0.001。小鼠的脾單個核細胞，在LCWE注射后3h開始升高(19.32％)，12h達高峰(38.8％)，以后明顯下降，24h為9.89％；其外周血單個核細胞表達CD4~+CD69~+T細胞百分率的走勢與此一致。但脾單個核細胞表達CD4~+CD69~+T細胞的百分率高于外周血單個核細胞，P＜0.001。體內(nèi)T細胞CD69一過性高表達之后下降速度快、幅度大。LCWE刺激體外CD4~+T細胞CD69表達增加，其峰值高，與LCWE體內(nèi)刺激比較，P＞0.05。 結(jié)論：①LCWE誘導小鼠產(chǎn)生嚴重的免疫性損傷和冠狀動脈炎的作用是通過超抗原機制實現(xiàn)的：②LCWE可直接誘導早期T細胞活化，具體表現(xiàn)為CD4~+CD69~+T細胞顯著增高；③LCWE誘導機體產(chǎn)生炎性細胞因子TNF-α顯著增多，該炎性因子可能是引起冠狀動脈炎產(chǎn)生的重要機制。阻斷TNF-α的活性有可能成為川崎病治療的藥物靶點。 三、白三烯B4受體在免疫性血管炎發(fā)病機制中的作用 目的：研究冠狀動脈炎模型小鼠心臟和肝臟中BLT1 mRNA和BLT2 mRNA的表達；模型小鼠脾臟中CD4~+T細胞BLT2的表達，探討LTB—BLT1、LTB—BLT2通路在小鼠冠狀動脈炎發(fā)生中的作用。 方法：采用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(RT—PCR)的方法，提取細胞總RNA，以Olig(dT)引導合成cDNA第一鏈，經(jīng)PCR擴增，以BLT1或BLT2為引物，，從心臟和肝臟組織中擴增出BLT1 mRNA或BLT2 mRNA。采用凝膠圖像分析儀分析BLT1與β-actin mRNA及BLT2與β-actin mRNA的表達水平；應用流式細胞術間接熒光標記檢測脾單個核細胞中CD4~+T細胞上BLT2的表達。采用夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法，檢測血漿IL-1β、IL-6和TNF-α水平。 結(jié)果：擴增出分子量為430 bp的BLT1 mRNA和分子量為331 bp BLT2 mRNA。模型小鼠在注射LCWE后6h開始升高，12h達高峰，持續(xù)至3d逐漸降低，5d時回到基線；心臟和肝臟表達BLT1 mRNA和BLT2 mRNA，分別進行組內(nèi)各時間點比較，注射LCWE后12小時，BLT1 mRNA和BLT2 mRNA的光密度比值顯著升高，P＜0.05。流式細胞術檢測顯示，在注射LCWE后1d小鼠脾臟BLT2~+CD4~+T細胞表達高峰，高峰時間較BLT2 mRNA在心臟和肝臟的表達延遲。模型小鼠注射LCWE后3d血漿TNF-α、IL-1及IL-6水平較對照組比較明顯增高，P＜0.001。 結(jié)論：在LCWE誘導的小鼠免疫性損傷和冠狀動脈炎的產(chǎn)生過程中，BLT1、BLT2在肝臟和心臟高表達：在脾單個核細胞BLT2在CD4~+T細胞表達增加。LCWE能誘導小鼠TNF-α，IL-1β，IL-6等多種炎性介質(zhì)分泌增加。因此，LTB-BLT1、LTB—BLT2通路可能在小鼠冠狀動脈炎發(fā)生中起重要作用。 第二部分 靜脈輸注丙種球蛋白防治川崎病冠狀動脈病變的療效評價 目的：客觀評價靜脈輸注丙種球蛋白(IVIG)治療和預防川崎病(KD)冠狀動脈病變(CAL)的療效，探討IVIG療效的影響因素。 方法：對314例KD患兒進行回顧性對比觀察。按照治療分為阿斯匹林(ASA)+IVIG組和ASA組，觀察兩組CAL發(fā)生、恢復情況、不同時機不同劑量IVIG治療KD療效，及平均住院時間、退熱時間、總熱程、血小板計數(shù)、血沉、C反應蛋白等臨床及實驗室指標，急性期出現(xiàn)CAL者分別于病程1m，3m，6m，12m復查。 結(jié)果：ASA+IVIG組CAL發(fā)生率34.3％，ASA組56.0％，兩組比較P＜0.001。應用IVIG 2.0 g／kg或1.0 g／kg以及在病程3～10天應用IVIG，CAL發(fā)生率低，P＜0.05。22.2％CAL發(fā)生在IVIG治療后：13.4％CAL在病程12月仍不能恢復正常，多數(shù)為IVIG治療開始時間超過10天者。ASA+IVIG組住院時間、退熱時間、總熱程縮短，血小板計數(shù)、血沉、C反應蛋白顯著降低(P＜0.05)。IVIG耐藥病例占10.5％。 結(jié)論：IVIG治療可顯著縮短KD病程和降低CAL事件發(fā)生，但對川崎病CAL防治并非人們所預期的那樣有效，其實際療效需要再評價。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R-332

【參考文獻】

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本文編號：1481527