發(fā)布時(shí)間：2018-01-29 20:02

  本文關(guān)鍵詞： 鼠疫耶爾森氏菌 炭疽芽孢桿菌 實(shí)時(shí)PCR 標(biāo)識(shí)序列 莢膜因子 水腫因子　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2005年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:建立簡(jiǎn)便、快速、特異的實(shí)時(shí)定量PCR快速檢測(cè)鑒定技術(shù),用于鼠疫耶爾森氏菌和炭疽芽孢桿菌快速鑒定與定量檢測(cè)。 方法:利用SYBR Green Ⅰ隨機(jī)摻入法的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),建立、優(yōu)化實(shí)時(shí)定量PCR快速檢測(cè)反應(yīng)體系,針對(duì)特異的染色體標(biāo)識(shí)序列設(shè)計(jì)引物,檢測(cè)鼠疫耶爾森氏菌;針對(duì)位于兩個(gè)毒力相關(guān)質(zhì)粒上的莢膜因子和水腫因子基因設(shè)計(jì)引物,檢測(cè)炭疽芽孢桿菌。試驗(yàn)評(píng)價(jià)了方法的特異性、靈敏度,以盲測(cè)試驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證;考核了方法的重復(fù)性;檢測(cè)了模擬污染的土壤和臟器標(biāo)本,試驗(yàn)中分別根據(jù)各菌序列設(shè)計(jì)內(nèi)部對(duì)照引物,構(gòu)建相應(yīng)內(nèi)對(duì)照以消除假陰性的干擾。結(jié)果:(1) 建立了實(shí)時(shí)定量PCR快速檢測(cè)鑒定鼠疫耶爾森氏菌的反應(yīng)體系及條件,對(duì)我國(guó)18個(gè)生態(tài)型共計(jì)275株鼠疫耶爾森氏菌的檢測(cè)結(jié)果均出現(xiàn)特異擴(kuò)增峰,而相關(guān)32株非鼠疫耶爾森氏菌均呈陰性,定性盲測(cè)試驗(yàn)結(jié)果顯示100%判斷準(zhǔn)確,兩次定量盲測(cè)試驗(yàn)Cp值與濃度的相關(guān)系數(shù)分別為0.979、0.985,檢測(cè)靈敏度為1.6 CFU/反應(yīng)體系,肝、脾、肺模擬標(biāo)本檢測(cè)靈敏度為4000 CFU/反應(yīng)體系;(2) 建立了實(shí)時(shí)定量PCR快速檢測(cè)鑒定炭疽芽孢桿菌的反應(yīng)體系及條件,檢測(cè)14株炭疽芽孢桿菌均出現(xiàn)特異的擴(kuò)增結(jié)果,而29株非炭疽芽孢桿菌的擴(kuò)增均為陰性;定性盲測(cè)試驗(yàn)結(jié)果顯示100%判斷準(zhǔn)確,兩個(gè)克隆質(zhì)粒的定量盲測(cè)試驗(yàn)的Cp值與濃度的相關(guān)系數(shù)分別為0.994、0.990,檢測(cè)炭疽桿菌基因組DNA的靈敏度可達(dá)每反應(yīng)體系0.53pg;兩個(gè)克隆株提取質(zhì)粒的檢測(cè)限分別為每反應(yīng)體系12拷貝和140拷貝,土壤模擬污染標(biāo)本檢測(cè)靈敏度可達(dá)36個(gè)芽孢/反應(yīng)體系。 結(jié)論:該方法應(yīng)用于鼠疫耶爾森氏菌和炭疽芽孢桿菌的檢測(cè)鑒定簡(jiǎn)便、快捷,具有良好的特異性和敏感性,內(nèi)對(duì)照的設(shè)置避免了環(huán)境或臨床實(shí)際樣品處理不當(dāng)所造成的假陰性結(jié)果,為防范生物恐怖襲擊、應(yīng)對(duì)緊急疫情的發(fā)生、動(dòng)態(tài)的疫源地疫情監(jiān)測(cè)提供了快速檢測(cè)鑒定的有力手段。
[Abstract]:Objective: to establish a simple, rapid and specific real-time quantitative PCR rapid detection and identification technique for the rapid identification and quantitative detection of Yersinia pestis and Bacillus anthracis. Methods: using the real-time quantitative PCR technique of SYBR Green 鈪，

本文編號(hào)：1474235